O protocolo combina o isolamento específico da idade de culturas mistas espontâneas derivadas de células-tronco neurais contendo células precursoras e astrócitos diferenciadas, ensaios imitando condições patológicas e leituras robustas e de alto conteúdo. Essas características possibilitam o estudo diferencial da milinação do desenvolvimento e da remielinação adulta em condições fisiológicas e patológicas e em um microambiente que leve em consideração a contribuição dos astrócitos. Para o isolamento neural de células-tronco do dia embrionário 13,5 a 14,5 cérebros fetais, coloque as cabeças dos embriões em uma placa de Petri limpa com PBS gelado e use fórceps para remover a pele do crânio sob ampliação.
Uma vez que o cérebro esteja visível e limpo da pele, use fórceps para espremer o cérebro para fora do crânio e remover o cerebelo. Use os fórceps para remover as meninges e coloque o tecido isolado no tampão de dissociação não enzimática. Quando todo o tecido cerebral tiver sido isolado, puxe de duas a três amostras em 150 microliters de tampão de dissociação não enzimática por tubo de 1,5 mililitro, e incubar os tubos por 15 minutos a 37 graus Celsius com agitação contínua.
Ao final da incubação, adicione 850 microliters de meio padrão a cada tubo e pipeta para misturar até que a suspensão esteja livre de aglomerados. Se o tecido não dissociado ainda estiver visível, deixe que as amostras descansem por dois minutos para permitir que os tecidos se acomodem na parte inferior dos tubos. Quando a dissociação estiver completa, as células da placa a uma densidade de 10 a 50 células por microliter em 10 a 30 mililitros de concentração média da neurosfera em um frasco T25 ou T45, e colocam o frasco na incubadora de cultura celular em uma posição vertical para evitar o apego celular.
de camundongos adultos de 2,5 meses de idade, coloque cérebros de quatro a cinco ratos adultos em um tubo de 50 mililitros de HBSS gelado e coloque um cérebro, lado ventral para baixo, na direção rostral-caudal em um frasco estéril coberto de papel alumínio cheio com menos 20 graus Celsius de água fria durante a noite. Use uma lâmina de barbear para remover as lâmpadas olfativas e para cortar de duas a três fatias coronais de um milímetro de espessura do córtex para o chiasma óptico. Coloque as fatias na superfície fria em uma posição ventro-dorsal, e identifique o corpus caloso e os dois ventrículos laterais.
Utilizando ampliação, isole as paredes dos ventrículos laterais, tomando cuidado para não incluir pedaços do caloso corpus, e coloque o tecido isolado em cinco a 10 mililitros de tampão de dissociação enzimática para uma incubação de 15 minutos a 37 graus Celsius. No final da incubação, pipete os tecidos pelo menos 50 vezes antes de incubar as amostras a 37 graus Celsius por mais 10 minutos. No final da incubação, neutralize a trippsina com cinco mililitros de cultura padrão e filtre a suspensão do tecido através de um filtro de 70 mícrons.
Centrifugar a solução filtrada por cinco minutos a 400 vezes g, e suspender a pelota em solução de sacarose para uma segunda centrifugação. No final da centrifugação, suspenda novamente a pelota na solução de lavagem de albumina de soro bovino para outra centrifugação, depois suspenda novamente a pelota no meio de cultura padrão para contagem e emplaque as células em um frasco T-25 ou T-45 vertical. Para diferenciação da neurosfera primária, adicione fatores básicos de fibroblasto e crescimento endotelial à cultura de células-tronco neurais a cada dois dias.
Quando as neuroesferas atingirem um diâmetro de 100 a 500 mícrons, passagem as células por dissociação mecânica de acordo com os protocolos padrão. Para diferenciação de oligosfera, trate as células com fator básico de crescimento do fibroblasto no fator derivado de plaquetas-AA a cada dois dias. Quando as oligosferas atingem um diâmetro de 100 a 150 mícrons, dissociam as esferas por dissociação mecânica de acordo com os protocolos padrão e semeam a suspensão celular a uma densidade de 3000 células por centímetro quadrado em placas revestidas de laminina poli-DL-ornithine.
Após três dias, substitua o supernatante de cada cultura pelo mesmo volume de meio de diferenciação oligodendrocida. Para realizar uma indução de bloco de diferenciação mediada por inflamação, após a dissociação da neurosfera e durante a produção da oligosfera, adicione a mistura de citocina de interesse ao meio da cultura. Para induzir a morte celular de privação de oxigênio-glicose, dois dias após a semeadura nas placas multi-poços, transfira o supernante de cada cultura para poços individuais de uma placa multi-poço.
Adicione metade do volume de meio OGD aos poços, e transfira as culturas para uma câmara hermética de hipóxia saturada com 95% de nitrogênio e 5% de dióxido de carbono. Coloque a câmara na incubadora de cultura celular. Após três horas, substitua o meio nas câmaras pelo conjunto médio à placa de cultura multi-poço.
Depois de verificar a qualidade da coloração celular, no menu Aquisição do software de triagem de alto conteúdo, selecione o tempo de exposição fixa e mini scan, e selecione 10 campos por poço e dois poços por condição experimental para permitir que os parâmetros de análise no subconjunto de campos sejam definidos para toda a placa. Siga o fluxo de trabalho passo a passo para desenvolver todo o algoritmo. Selecione Processar imagem para cada canal e clique em Remoção de fundo para selecionar o nível de sinal desejado.
Para identificar e selecionar os núcleos por coloração nuclear, clique em Identificar objeto primário, ajustar o limiar para identificar núcleos únicos e clicar em Validar objetos primários para definir os limiares com base nas áreas e posição do objeto. Clique em Identificar pontos para cada canal correspondente aos marcadores específicos de linhagem e definir a largura do valor do anel para três e a distância a zero para permitir a identificação da fluorescência citoplasmática. Selecione os níveis de referência no fluxo de trabalho para construir a análise e para permitir a contagem automática dos núcleos condensados com base no tamanho nuclear e intensidade de coloração nuclear e das células específicas marcador-positivas baseadas na fluorescência citoplasmática identificada pelo anel, em seguida, clique em Reproduzir.
Durante a primeira fase da cultura, as células-tronco neurais mantêm sua expressão de ninho. A maioria das células também são NG2-positivas. As células positivas do CNPase correspondentes ao estágio pré-oligodendrocyto são detectáveis de três a seis dias após a indução de diferenciação mediada por T3, enquanto oligodendrocitos maduros mbp positivos aparecem em uma porcentagem significativa após seis a 12 dias in vitro.
A análise de triagem de alto teor de conteúdo permite a detecção de células únicas dentro da cultura através da análise de coloração nuclear e intensidade de fluorescência. A composição da cultura no final da fase de diferenciação difere dependendo se as culturas são de origem fetal ou adulta, com culturas fetais mais responsivas à diferenciação mediada por T3, e atingindo uma porcentagem maior de oligodendrocitos maduros. Observe que quando as células precursoras do oligodendrocyte derivadas de células-tronco neurais são semeadas a uma alta densidade, elas se agregam, e os astrócitos replicantes produzem rapidamente uma camada celular confluente, impedindo a observação da forma característica da rede de aranhas de oligodendrocitos maduros.
Mediado por inflamação, o bloqueio diferenciado induz uma forte diminuição nos oligodenrócitos pré e maduros, conforme detectado pelas manchas de CNPase e MBP nas culturas fetal e adulta. Um aumento no número de células precursoras oligodendrocytos também ocorre em culturas adultas tratadas com citocinas. Enquanto as células precursoras do oligodendrocyte fetal e adulto mostram o mesmo à exposição inflamatória de citocinas, apenas culturas derivadas do fetal são sensíveis à toxicidade da privação de oxigênio-glicose.
O método pode ser implementado com qualquer tipo de células precursoras oligodendrocyte, processo de diferenciação e amadurecimento, para testar novas estratégias visando combater doenças que afetam a mielinação ou remielinização
