Das Protokoll kombiniert die altersspezifische Isolierung von aus neuronalen Stammzellen gewonnenen spontanen Mischkulturen, die differenzierende Oligodendrozyten-Vorläuferzellen und Astrozyten, Assays, die pathologische Zustände nachahmen, und robuste, inhaltsreiche Auslesungen enthalten. Diese Eigenschaften ermöglichen es, die Entwicklungsmyelinisierung und die Remyelinisierung bei Erwachsenen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen und in einer Mikroumgebung, die den Beitrag von Astrozyten berücksichtigt, unterschiedlich zu untersuchen. Für die neurale Stammzellisolierung vom embryonalen Tag 13,5 bis 14,5 der fetalen Vorderhirne legen Sie die Köpfe der Embryonen in eine saubere Petrischale mit eiskaltem PBS und entfernen Sie mit einer Pinzette die Haut unter Vergrößerung vom Schädel.
Sobald das Gehirn sichtbar und von der Haut befreit ist, drücken Sie das Gehirn mit einer Pinzette aus dem Schädel und entfernen Sie das Kleinhirn. Verwenden Sie die Pinzette, um die Hirnhäute zu entfernen und das isolierte Gewebe in den nicht-enzymatischen Dissoziationspuffer zu legen. Wenn das gesamte Hirngewebe isoliert ist, ziehen Sie zwei bis drei Proben in 150 Mikroliter nicht-enzymatischen Dissoziationspuffer pro 1,5 Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie die Röhrchen für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius unter kontinuierlichem Schütteln.
Am Ende der Inkubation werden 850 Mikroliter Standardmedium in jedes Röhrchen gegeben und zum Mischen pipettiert, bis die Suspension frei von Klumpen ist. Wenn nicht dissoziiertes Gewebe noch sichtbar ist, lassen Sie die Proben zwei Minuten ruhen, damit sich das Gewebe auf dem Boden der Röhrchen absetzen kann. Wenn die Dissoziation abgeschlossen ist, platten Sie Zellen mit einer Dichte von 10 bis 50 Zellen pro Mikroliter in 10 bis 30 Millilitern Neurosphärenmittelkonzentration in einem T25- oder T45-Kolben und legen Sie den Kolben in den Zellkulturinkubator in eine vertikale Position, um die Zellanheftung zu verhindern.
Von 2,5 Monate alten erwachsenen Mäusen legen Sie Gehirne von vier bis fünf erwachsenen Mäusen in eine 50-Milliliter-Röhre aus eiskaltem HBSS und legen Sie ein Gehirn mit der ventralen Seite nach unten in rostral-kaudaler Richtung auf einen sterilen, mit Aluminiumfolie bedeckten Kolben, der mit minus 20 Grad Celsius über Nacht kaltem Wasser gefüllt ist. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Riechkolben zu entfernen und zwei bis drei ein Millimeter dicke koronale Scheiben vom Kortex zum optischen Chiasma zu schneiden. Legen Sie die Scheiben in einer ventro-dorsalen Position auf die kalte Oberfläche und identifizieren Sie den Corpus callosum und die beiden lateralen Ventrikel.
Isolieren Sie mitHilfe der Vergrößerung die Wände der lateralen Ventrikel, achten Sie darauf, keine Stücke des Corpus callosum aufzunehmen, und legen Sie das isolierte Gewebe in fünf bis 10 Milliliter enzymatischen Dissoziationspuffer für eine 15-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation pipettieren Sie die Gewebe mindestens 50 Mal, bevor Sie die Proben bei 37 Grad Celsius für weitere 10 Minuten inkubieren. Am Ende der Inkubation neutralisieren Sie das Trypsin mit fünf Millilitern Standardkulturmedium und filtern die Gewebesuspension durch einen 70-Mikron-Filter.
Zentrifugieren Sie die gefilterte Lösung fünf Minuten lang bei 400 g und suspendieren Sie das Pellet in Saccharoselösung für eine zweite Zentrifugation erneut. Am Ende der Zentrifugation wird das Pellet in einer Rinderserumalbumin-Waschlösung für eine weitere Zentrifugation erneut suspendiert, dann das Pellet in einem Standardkulturmedium zum Zählen erneut suspendiert und die Zellen in einem aufrechten T-25- oder T-45-Kolben plattiert. Für die primäre Neurosphärendifferenzierung fügen Sie der neuralen Stammzellkultur alle zwei Tage grundlegende Fibroblasten- und endotheliale Wachstumsfaktoren hinzu.
Wenn die Neurosphären einen Durchmesser von 100 bis 500 Mikrometern erreichen, passieren die Zellen durch mechanische Dissoziation gemäß Standardprotokollen. Behandeln Sie zur Oligosphärendifferenzierung die Zellen alle zwei Tage mit einem basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor in Thrombozyten-abgeleitetem Faktor-AA. Wenn die Oligosphären einen Durchmesser von 100 bis 150 Mikrometern erreichen, dissoziieren Sie die Kugeln durch mechanische Dissoziation gemäß Standardprotokollen und säen Sie die Zellsuspension mit einer Dichte von 3000 Zellen pro Quadratzentimeter auf Poly-DL-Ornithin-Laminin-beschichtete Platten.
Ersetzen Sie nach drei Tagen den Überstand jeder Kultur durch das gleiche Volumen des Oligodendrozyten-Differenzierungsmediums. Um eine entzündungsvermittelte Differenzierungsblockinduktion durchzuführen, wird nach der Dissoziation der Neurosphären und während der Oligosphärenproduktion die interessierende Zytokinmischung dem Kulturmedium hinzugefügt. Um den Sauerstoff-Glukose-Deprivationszelltod zu induzieren, wird zwei Tage nach der Aussaat in die Multi-Well-Platten der Überstand aus jeder Kultur in einzelne Vertiefungen einer Multi-Well-Platte übertragen.
Fügen Sie die Hälfte des Volumens des OGD-Mediums zu den Vertiefungen hinzu und übertragen Sie die Kulturen in eine luftdichte Hypoxiekammer, die mit 95% Stickstoff und 5% Kohlendioxid gesättigt ist. Legen Sie die Kammer in den Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie nach drei Stunden das Medium in den Kammern durch das Medium, das von der Multi-Well-Kulturplatte abgesehen ist.
Nachdem Sie die Qualität der Zellfärbung überprüft haben, wählen Sie im Menü Erfassung der High-Content-Screening-Software feste Belichtungszeit und Mini-Scan und wählen Sie 10 Felder pro Vertiefung und zwei Vertiefungen pro experimenteller Bedingung aus, damit die Analyseparameter in der Teilmenge der Felder für die gesamte Platte eingestellt werden können. Folgen Sie dem Workflow Schritt für Schritt, um den gesamten Algorithmus zu entwickeln. Wählen Sie Bild für jeden Kanal verarbeiten und klicken Sie auf Hintergrundentfernung, um den gewünschten Signalpegel auszuwählen.
Um die Kerne durch Kernfärbung zu identifizieren und auszuwählen, klicken Sie auf Primäres Objekt identifizieren, passen Sie den Schwellenwert an, um einzelne Kerne zu identifizieren, und klicken Sie auf Primäre Objekte validieren, um die Schwellenwerte basierend auf Objektbereichen und Position festzulegen. Klicken Sie auf Flecken identifizieren für jeden Kanal, der den spezifischen Linienmarkern entspricht, und legen Sie die Ringwertbreite auf drei und den Abstand auf Null fest, um die Identifizierung der zytoplasmatischen Fluoreszenz zu ermöglichen. Wählen Sie Referenzwerte im Workflow aus, um die Analyse zu erstellen und die automatische Zählung der kondensierten Kerne basierend auf der Kerngröße und der Kernfärbungsintensität sowie der spezifischen markerpositiven Zellen basierend auf der vom Ring identifizierten zytoplasmatischen Fluoreszenz zu ermöglichen, und klicken Sie dann auf Wiedergabe.
Während der ersten Phase der Kultur behalten die neuralen Stammzellen ihre Nestinexpression bei. Die Mehrheit der Zellen ist auch NG2-positiv. CNPase-positive Zellen, die dem präolimonaddrozytenstadium entsprechen, sind drei bis sechs Tage nach T3-vermittelter Differenzierungsinduktion nachweisbar, während reife MBP-positive Oligodendrozyten in einem signifikanten Prozentsatz nach sechs bis 12 Tagen in vitro auftreten.
Die High-Content-Screening-Analyse ermöglicht den Nachweis einzelner Zellen innerhalb der Kultur durch Kernfärbung und Fluoreszenzintensitätsanalyse. Die Zusammensetzung der Kultur am Ende der Differenzierungsphase unterscheidet sich je nachdem, ob die Kulturen fetalen oder erwachsenen Ursprungs sind, wobei fetale Kulturen eher auf T3-vermittelte Differenzierung ansprechen und einen höheren Prozentsatz reifer Oligodendrozyten erreichen. Beachten Sie, dass, wenn aus neuralen Stammzellen gewonnene Oligodendrozyten-Vorläuferzellen mit einer hohen Dichte ausgesät werden, sie sich aggregieren und replizierende Astrozyten schnell eine konfluente Zellschicht erzeugen, die die Beobachtung der charakteristischen Spinnennetzform reifer Oligodendrozyten verhindert.
Entzündungsvermittelte Differenzierungsblockierung induziert eine starke Abnahme der prä- und reifen Oligodendrozyten, wie durch CNPase- und MBP-Färbung sowohl in fetalen als auch in erwachsenen Kulturen nachgewiesen. Eine Zunahme der Anzahl der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen tritt auch in zytokinbehandelten erwachsenen Kulturen auf. Während fetale und adulte Oligodendrozyten-Vorläuferzellen die gleiche exposition gegenüber entzündlichen Zytokinen aufweisen, reagieren nur fetale Kulturen empfindlich auf Sauerstoff-Glukose-Deprivationstoxizität.
Die Methode kann mit jeder Art von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, Differenzierungs- und Reifestörungsprozess, implementiert werden, um neue Strategien zur Bekämpfung von Krankheiten zu testen, die die Myelinisierung oder Remyelinisierung beeinflussen
