Estos principios de diseño, recopilación de datos y análisis de sistemas de sobremesa se pueden utilizar como una base racional para el estudio in vitro de terapias mejoradas de cavitación. Nuestras técnicas permiten pruebas de alto rendimiento al tiempo que preservan los atributos experimentales críticos de monitoreo de cavitación por intervalos, alineación de muestras repetibles y compatibilidad con métodos comunes de análisis celular. La terapia mejorada por cavitación tiene múltiples aplicaciones potenciales, incluido el tratamiento de enfermedades como el cáncer y el accidente cerebrovascular.
Al comprender mejor los mecanismos subyacentes, podemos desarrollar mejores terapias. Este trabajo proporciona un marco de diseño e implementación de sistemas fácilmente reproducible para permitir la investigación de una amplia variedad de efectos biocelulares inducidos por cavitación. Incluyendo la administración de fármacos, sonoporación y sonoimpresión.
Obtener resultados significativos requiere garantizar la reproducibilidad y el control de todas las variables del experimento. Es imprescindible realizar todos los controles pertinentes y medir el ruido eléctrico. Para la preparación de los sistemas de transfección acústica, desgasificar el líquido de llenado bajo una presión de 100kPa durante al menos dos horas para minimizar la probabilidad de cavitación en el trayecto de propagación.
Se recomienda la confirmación con una sonda de oxígeno disuelto de que la presión parcial de oxígeno está por debajo de 10kPa. Llene la cámara de prueba lentamente para minimizar la reintroducción de aire en el líquido desgastado y elimine inmediatamente cualquier burbuja residual del transductor y las superficies del contenedor medio. Permita que el amplificador de potencia de la fuente de ultrasonido se caliente por recomendación del fabricante para que la ganancia y la salida sean estables con respecto al tiempo.
Y diluya el agente de cavitación mientras se agita suave y continuamente para hacer una suspensión uniforme sin atrapar burbujas macro o destruir el agente. Cuando trabaje con microburbujas, asegúrese de manejarlas con cuidado. Para la preparación de SAT2, antes de comenzar el experimento, use etanol para esterilizar la tapa de los PDP.
Presione ajustar la tapa esterilizada al plato de cultivo para formar el compartimiento celular y cargar una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja roma de calibre 18 con 10 mililitros del líquido de llenado. Inserte la aguja a través de uno de los orificios de relleno de PD y llene lentamente la cámara mientras se inclina para que las burbujas macro puedan escapar a través del orificio de relleno abierto. Cuando se haya llenado la cámara, inserte una varilla de polímero de cuatro a cinco milímetros en el orificio abierto y coloque el conjunto de modo que los orificios sean horizontales.
Retire la aguja mientras inyecta líquido adicional para que el aire no se atrajo en la cámara y cierre el orificio de relleno con otra varilla de polímero. Revise visualmente el compartimiento en busca de evidencia de macro burbujas atrapadas y presione para colocar el compartimiento de exposición celular en el soporte del compartimiento. Considere la flotabilidad de las partículas en suspensión y cómo su flotabilidad afectará su contacto con las células al decidir la orientación del compartimiento de exposición celular.
Luego, bajando la tapa de la cámara en un ángulo horizontal para desalentar que las burbujas macro descansen en las partes sumergidas del dispositivo, instale la tapa en la parte superior de la cámara. Antes de realizar las mediciones experimentales, permita que la suspensión se equilibre térmicamente con la temperatura de la cámara. Uso de un termopar de aguja fina para confirmar que la temperatura en la cámara se ha estabilizado.
Para monitorear los experimentos en tiempo real, tanto en el dominio del tiempo como en el de la frecuencia, inicie el proceso de recopilación de datos y encienda la señal de la unidad de la fuente de ultrasonido. Utilice una sonda de alto voltaje para monitorear la señal de salida del amplificador que impulsa la fuente de ultrasonido durante todo el experimento para asegurarse de que la exposición está procediendo según lo esperado. Y asegúrese de que el osciloscopio esté configurado para compensar la atenuación de la sonda.
La supervisión del dominio del tiempo del detector de cavitación pasiva revela si las señales tienen el tamaño adecuado para la configuración de instrumentación actual y si las señales de cavitación se ven antes de lo esperado. El monitoreo del dominio de frecuencia permite el análisis del tipo de comportamiento de la burbuja y se puede utilizar para ajustar los niveles de accionamiento según sea necesario para lograr el estímulo celular deseado. En este análisis, a la presión incidente más baja, la respuesta pasiva del detector de cavitación, consistió enteramente en armónicos enteros de la frecuencia de ultrasonido fundamental de 0.5MHz.
El aumento de 0.2 a 0.3MPa resultó en armónicos ultra pronunciados en el espectro, además de otros armónicos enteros elevados. Las formas de onda del dominio del tiempo en estas dos presiones parecían similares, aunque los resultados de 0,3MPa demostraron más variabilidad durante la duración del pulso. A la presión más alta, la amplitud de la forma de onda del dominio del tiempo creció no linealmente en relación con las presiones más bajas como resultado de un ruido de banda ancha claramente elevado, probablemente debido a la cavitación inercial causada por la destrucción de micro burbujas.
Aquí, los espectros completos se muestran durante un tiempo de exposición de 50 segundos durante el cual la fuente emitió pulsos de dos milisegundos cada 0,2 segundos. Como se observa en este gráfico, ilustrando las potencias armónicas y de banda ancha totales correspondientes, se generaron respuestas de banda ancha de gran amplitud con el pico inicial que se considera que se correlaciona con la destrucción de las burbujas más grandes. Después de unos segundos, la respuesta de banda ancha disminuye rápidamente, aparentemente debido a la destrucción de burbujas.
En este análisis utilizando una dilución de 20 a 1 de micro burbujas y PBS normal, los espectros promedio de tiempo y muestra mostraron que el detector de cavitación pasiva desenfocado contenía una respuesta de banda ancha más fuerte que el detector de enfoque. Acompañado de una reducción de la variabilidad de la muestra a la muestra en los poderes armónicos y ultra armónicos. Los efectos biológicos inducidos por cavitación se pueden evaluar mediante técnicas como la microscopía de fluorescencia, la citometría de flujo o los ensayos biológicos.
Esto permite el establecimiento de una relación robusta entre la actividad de cavitación y los efectos biológicos. Esta técnica nos ha permitido identificar mejor las relaciones entre el comportamiento de la burbuja y los efectos biológicos que han revelado algunos nuevos mecanismos potenciales que sustentan la administración de fármacos mediada por cavitación.
