Эти принципы проектирования настольных систем, сбора данных и анализа могут быть использованы в качестве рациональной основы для изучения in vitro кавитационной улучшенной терапии. Наши методы обеспечивают высокую пропускную способность тестирования при сохранении критических экспериментальных атрибутов интервального кавитационного мониторинга, повторяемого выравнивания образцов и совместимости с распространенными методами клеточного анализа. Кавитационная усиленная терапия имеет несколько потенциальных применений, включая лечение таких заболеваний, как рак и инсульт.
Лучше понимая лежащие в основе механизмы, мы можем разработать лучшие методы лечения. Эта работа обеспечивает легко воспроизводимую структуру проектирования и реализации системы, позволяющую исследовать широкий спектр клеточных биоэффектов, вызванных кавитацией. В том числе доставка лекарств, сонопорация и сонопечать.
Получение значимых результатов требует обеспечения воспроизводимости и контроля всех переменных в эксперименте. Крайне важно выполнить все соответствующие элементы управления и измерить электрический шум. Для подготовки систем к акустической трансфекции дегазация заполняемой жидкости под давлением 100 кПа в течение не менее двух часов для минимизации вероятности кавитации в пути распространения.
Рекомендуется подтверждение с помощью зонда растворенного кислорода, что парциальное давление кислорода ниже 10 кПа. Медленно заполняйте испытательную камеру, чтобы свести к минимуму повторное введение воздуха в дегазированную жидкость, и немедленно очистите любые остаточные пузырьки с поверхностей датчика и контейнера для среды. Позвольте усилителю мощности ультразвукового источника нагреваться в соответствии с рекомендацией производителя, чтобы коэффициент усиления и выход были стабильными по отношению ко времени.
И разбавьте кавитационный агент, мягко и непрерывно перемешивая, чтобы получить однородную суспензию, не заражая макропузырьки и не разрушая агент. При работе с микропузырьками обязательно обрабатывайте их осторожно. Для приготовления SAT2 перед началом эксперимента используйте этанол для стерилизации крышки PDM.
Прижмите стерилизованную крышку к чашке для культивирование, чтобы сформировать ячейку отсека и загрузить 10-миллилитровой шприц, оснащенный тупой иглой 18 калибра с 10 миллилитрами заполняемой жидкости. Вставьте иглу через одно из заполненных отверстий PPM и медленно заполняйте камеру при наклоне, чтобы макропузырьки могли выйти через открытое заливное отверстие. Когда камера будет заполнена, вставьте четырех-пятимиллиметровый полимерный стержень в открытое отверстие и расположите узел так, чтобы отверстия были горизонтальными.
Извлеките иглу во время впрыскивания дополнительной жидкости, чтобы воздух не втягивается в камеру, и закройте заливное отверстие другим полимерным стержнем. Визуально проверьте отсек на наличие застрявных макропузырьков и прижмите поместить отсек для экспозиции ячейки в держатель отсека. Рассмотрим плавучесть частиц в суспензии и то, как их плавучесть повлияет на их контакт с клетками при принятии решения об ориентации клеточного экспозиционного отсека.
Затем, опуская крышку камеры под горизонтальным углом, чтобы предотвратить макропузырьки от покояния на погруженных частях устройства, установите крышку на верхнюю часть камеры. Перед выполнением экспериментальных измерений позвольте суспензии термически уравновесить температуру камеры. Использование тонкоигольчатой термопары для подтверждения того, что температура в камере стабилизировалась.
Для мониторинга экспериментов в режиме реального времени, как во временной, так и в частотной областях, запустите процесс сбора данных и включите сигнал источника ультразвука. Используйте высоковольтный зонд для мониторинга выходного сигнала усилителя, который управляет ультразвуковым источником на протяжении всего эксперимента, чтобы гарантировать, что воздействие происходит так, как ожидалось. И убедитесь, что осциллограф настроен на компенсацию затухания зонда.
Мониторинг пассивного кавитационного детектора во временной области показывает, соответствуют ли сигналы текущим настройкам приборов и видны ли кавитационные сигналы раньше, чем ожидалось. Мониторинг частотной области позволяет анализировать тип поведения пузырьков и может использоваться для регулировки уровней привода по мере необходимости для достижения желаемого клеточного стимула. В этом анализе при самом низком падающих давлении пассивная реакция детектора кавитации полностью состояла из целочисленных гармоник фундаментальной ультразвуковой частоты 0,5 МГц.
Увеличение с 0,2 до 0,3 МПа приводило к выраженным ультрагармоникам в спектре в дополнение к дальнейшему повышенному целочисленным гармоникам. Формы волн во временной области при этих двух давлениях выглядели одинаково, хотя результаты 0,3 МПа продемонстрировали большую изменчивость в течение длительности импульса. При самом высоком давлении амплитуда формы волны во временной области росла нелинейно относительно более низких давлений в результате явно повышенного широкополосного шума, вероятно, из-за инерционной кавитации, вызванной разрушением микропузырьков.
Здесь полные спектры показаны в течение 50-секундного времени экспозиции, в течение которого источник излучал два миллисекундных импульса каждые 0,2 секунды. Как видно на этом графике, иллюстрируя соответствующие общие гармонические и широкополосные мощности, широкополосные ответы с большой амплитудой были сгенерированы с первоначальным всплеском, который, как считается, коррелирует с разрушением крупнейших пузырьков. Через несколько секунд широкополосный отклик быстро уменьшается, по-видимому, из-за разрушения пузырьков.
В этом анализе с использованием разбавления микропузырьков от 20 до 1 и нормального PBS спектры времени и образца показали, что несфокусированный пассивный детектор кавитации содержал более сильный широкополосный отклик, чем детектор фокусировки. Сопровождается пониженной в выборке образец изменчивостью как в гармонической, так и в ультрагармонической степенях. Биоэффекты, вызванные кавитацией, могут быть оценены с использованием таких методов, как флуоресцентная микроскопия, проточная цитометрия или биологические анализы.
Это позволяет установить прочную связь между кавитационной активностью и биологическими эффектами. Этот метод позволил нам лучше идентифицировать взаимосвязи между поведением пузырьков и биологическими эффектами, которые выявили некоторые потенциальные новые механизмы, лежащие в основе кавитационной опосредования доставки лекарств.
