Diese Prinzipien für das Design, die Datenerfassung und die Analyse von Bench-Top-Systemen können als rationale Grundlage für die In-vitro-Untersuchung von kavitationsverstärkten Therapien verwendet werden. Unsere Techniken ermöglichen Hochdurchsatztests unter Beibehaltung der kritischen experimentellen Attribute der Intervallkavitationsüberwachung, der wiederholbaren Probenausrichtung und der Kompatibilität mit gängigen zellulären Analysemethoden. Die kavitationsverstärkte Therapie hat mehrere potenzielle Anwendungen, einschließlich der Behandlung von Krankheiten wie Krebs und Schlaganfall.
Durch ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen können wir bessere Therapien entwickeln. Diese Arbeit bietet einen leicht reproduzierbaren Systemdesign- und Implementierungsrahmen, um die Erforschung einer Vielzahl von kavitationsinduzierten zellulären Bioeffekten zu ermöglichen. Einschließlich Medikamentenabgabe, Sonoporation und Sonoprinting.
Um aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen, müssen Reproduzierbarkeit und Kontrolle für alle Variablen im Experiment sichergestellt werden. Es ist unerlässlich, alle relevanten Kontrollen durchzuführen und das elektrische Rauschen zu messen. Zur Vorbereitung der Systeme für die akustische Transfektion entgasen Sie die Füllflüssigkeit unter einem Druck von 100kPa für mindestens zwei Stunden, um die Wahrscheinlichkeit einer Kavitation im Ausbreitungsweg zu minimieren.
Es wird empfohlen, mit einer Sonde für gelösten Sauerstoff zu bestätigen, dass der Sauerstoffpartialdruck unter 10 kPa liegt. Füllen Sie die Prüfkammer langsam, um das Wiedereintreten von Luft in die entgaste Flüssigkeit zu minimieren und sofort Restblasen von den Oberflächen des Wandlers und des Mediumbehälters zu beseitigen. Lassen Sie den Leistungsverstärker der Ultraschallquelle gemäß der Empfehlung des Herstellers aufwärmen, damit die Verstärkung und der Ausgang in Bezug auf die Zeit stabil sind.
Und verdünnen Sie das Kavitationsmittel unter sanftem und kontinuierlichem Rühren, um eine gleichmäßige Suspension zu bilden, ohne Makroblasen einzufangen oder das Mittel zu zerstören. Wenn Sie mit Mikroblasen arbeiten, achten Sie darauf, sie sorgfältig zu behandeln. Verwenden Sie für die SAT2-Vorbereitung vor Beginn des Experiments Ethanol, um den PDM-Deckel zu sterilisieren.
Drücken Sie den sterilisierten Deckel auf die Kulturschale, um das Zellfach zu bilden, und laden Sie eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einer stumpfen 18-Gauge-Nadel ausgestattet ist, mit 10 Millilitern der Füllflüssigkeit. Führen Sie die Nadel durch eines der PDMs-Fülllöcher ein und füllen Sie die Kammer langsam beim Kippen, so dass Makroblasen durch das offene Füllloch entweichen können. Wenn die Kammer gefüllt ist, führen Sie einen vier bis fünf Millimeter großen Polymerstab in das offene Loch ein und positionieren Sie die Baugruppe so, dass die Löcher horizontal sind.
Entfernen Sie die Nadel, während Sie zusätzliche Flüssigkeit injizieren, damit keine Luft in die Kammer gezogen wird, und schließen Sie das Füllloch mit einem anderen Polymerstab. Überprüfen Sie das Fach visuell auf Anzeichen von eingefangenen Makroblasen und drücken Sie das Zellentlichtungsfach in den Fachhalter. Berücksichtigen Sie den Auftrieb der Partikel in Suspension und wie sich ihr Auftrieb auf ihren Kontakt mit Zellen auswirkt, wenn Sie die Ausrichtung des Zellexpositionskompartiments entscheiden.
Dann senken Sie den Kammerdeckel in einem horizontalen Winkel, um zu verhindern, dass Makroblasen auf den untergetauchten Teilen des Geräts ruhen, und installieren Sie den Deckel auf der Oberseite der Kammer. Bevor Sie die experimentellen Messungen durchführen, lassen Sie die Suspension thermisch mit der Kammertemperatur ausgleichen. Verwendung eines Feinnadel-Thermoelements, um zu bestätigen, dass sich die Temperatur in der Kammer stabilisiert hat.
Um die Experimente in Echtzeit sowohl im Zeit- als auch im Frequenzbereich zu überwachen, starten Sie den Datenerfassungsprozess und schalten Sie das Antriebssignal der Ultraschallquelle ein. Verwenden Sie eine Hochspannungssonde, um das Ausgangssignal des Verstärkers zu überwachen, das die Ultraschallquelle während des gesamten Experiments antreibt, um sicherzustellen, dass die Exposition wie erwartet verläuft. Und stellen Sie sicher, dass das Oszilloskop so eingestellt ist, dass es die Sondendämpfung kompensiert.
Die Zeitbereichsüberwachung des passiven Kavitationsdetektors zeigt, ob die Signale für die aktuellen Instrumentierungseinstellungen angemessen dimensioniert sind und ob die Kavitationssignale früher als erwartet gesehen werden. Die Frequenzbereichsüberwachung ermöglicht die Analyse der Art des Blasenverhaltens und kann verwendet werden, um die Antriebspegel nach Bedarf anzupassen, um den gewünschten Zellreiz zu erreichen. In dieser Analyse bestand die passive Kavitationsdetektorantwort beim niedrigsten einfallenden Druck vollständig aus ganzzahligen Oberschwingungen der 0,5 MHz-Ultraschallgrundfrequenz.
Die Erhöhung von 0,2 auf 0,3 MPa führte neben weiteren erhöhten ganzzahligen Oberschwingungen zu ausgeprägten Ultraharmonischen im Spektrum. Die Zeitbereichswellenformen bei diesen beiden Drücken sahen ähnlich aus, obwohl die 0,3MPa-Ergebnisse eine mehr Variabilität über die Pulsdauer zeigten. Beim höchsten Druck wuchs die Amplitude der Zeitbereichswellenform nichtlinear relativ zu den niedrigeren Drücken als Folge eines deutlich erhöhten Breitbandrauschens, wahrscheinlich aufgrund von Trägheitskavitation, die durch Mikroblasenzerstörung verursacht wurde.
Hier werden vollständige Spektren über eine Belichtungszeit von 50 Sekunden gezeigt, bei der die Quelle alle 0,2 Sekunden zwei Millisekundenpulse aussendete. Wie in dieser Grafik beobachtet, die die entsprechenden Oberschwingungs- und Breitbandleistungen veranschaulicht, wurden Breitbandreaktionen mit großer Amplitude erzeugt, wobei die anfängliche Spitze als korrelierend mit der Zerstörung der größten Blasen angesehen wurde. Nach einigen Sekunden nimmt die Breitbandreaktion rapide ab, offenbar aufgrund der Blasenzerstörung.
In dieser Analyse mit einer 20 zu 1-Verdünnung von Mikroblasen und normalem PBS zeigten die Zeit- und Probendurchschnittsspektren, dass der unfokussierte passive Kavitationsdetektor eine stärkere Breitbandantwort enthielt als der Fokusdetektor. Begleitet von einer reduzierten Sample-to-Sample-Variabilität sowohl in der harmonischen als auch in der ultraharmonischen Leistung. Kavitationsinduzierte Bioeffekte können mit Techniken wie Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie oder biologischen Assays bewertet werden.
Dies ermöglicht die Herstellung eines robusten Zusammenhangs zwischen kavitationsaktivität und den biologischen Effekten. Diese Technik hat es uns ermöglicht, die Beziehungen zwischen Blasenverhalten und biologischen Effekten besser zu identifizieren, die einige potenzielle neue Mechanismen aufgedeckt haben, die die kavitationsvermittelte Medikamentenabgabe untermauern.
