Esses princípios de design de sistema de bancada, coleta de dados e análise podem ser usados como base racional para o estudo in vitro de terapias aprimoradas da cavitação. Nossas técnicas permitem testes de alto rendimento, preservando os atributos experimentais críticos do monitoramento de cavitação de intervalo, alinhamento de amostras repetível e compatibilidade com métodos comuns de análise celular. A terapia aprimorada da cavitação tem múltiplas aplicações potenciais, incluindo o tratamento de doenças como câncer e derrame.
Ao entender melhor os mecanismos de sustentação, podemos desenvolver melhores terapias. Este trabalho fornece uma estrutura de design e implementação de sistemas facilmente reprodutíveis para permitir a pesquisa em uma grande variedade de efeitos biocelulares induzidos pela cavitação. Incluindo entrega de drogas, sonoporação e sonoimpressão.
Obter resultados significativos requer garantir a reprodutibilidade e o controle de todas as variáveis do experimento. É imprescindível realizar todos os controles relevantes e medir o ruído elétrico. Para a preparação dos sistemas de transfecção acústica, degas o líquido de enchimento sob uma pressão de 100kPa por pelo menos duas horas para minimizar a probabilidade de cavitação no caminho de propagação.
Recomenda-se a confirmação com uma sonda de oxigênio dissolvida de que a pressão parcial do oxigênio está abaixo de 10kPa. Encha lentamente a câmara de teste para minimizar a reintrodução do ar no líquido desgaseado e limpar imediatamente quaisquer bolhas residuais das superfícies do transdutor e médio do recipiente. Permita que o amplificador de energia de fonte de ultrassom aqueça conforme recomendação do fabricante para que o ganho e a saída sejam estáveis em relação ao tempo.
E diluir o agente de cavitação enquanto mexe suavemente e continuamente para fazer uma suspensão uniforme sem prender bolhas macro ou destruir o agente. Ao trabalhar com micro bolhas, certifique-se de manuseá-las com cuidado. Para a preparação do SAT2, antes de iniciar o experimento, use etanol para esterilizar a tampa dos PDMs.
Pressione colocar a tampa esterilizada no prato de cultura para formar o compartimento celular e carregar uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha cega de calibre 18 com 10 mililitros do líquido de enchimento. Insira a agulha através de um dos PDMs preencher buracos e encher lentamente a câmara enquanto inclina para que bolhas macro possam escapar através do orifício de preenchimento aberto. Quando a câmara estiver cheia, insira uma haste de polímero de quatro a cinco milímetros no orifício aberto e posicione o conjunto para que os orifícios sejam horizontais.
Remova a agulha enquanto injeta fluido extra para que o ar não seja puxado para dentro da câmara e feche o orifício de enchimento com outra haste de polímero. Verifique visualmente o compartimento em busca de evidências de bolhas macro presas e pressione encaixar o compartimento de exposição celular no suporte do compartimento. Considere a flutuação das partículas em suspensão e como sua flutuação afetará seu contato com as células ao decidir a orientação do compartimento de exposição celular.
Em seguida, abaixando a tampa da câmara em um ângulo horizontal para desencorajar bolhas macro de descansar sobre as partes submersas do dispositivo, instalar a tampa na parte superior da câmara. Antes de realizar as medições experimentais, permita que a suspensão se equilibre termicamente com a temperatura da câmara. Usando um termopar de agulha fina para confirmar que a temperatura na câmara estabilizou.
Para monitorar os experimentos em tempo real, tanto em domínios de tempo quanto de frequência, inicie o processo de coleta de dados e ligue o sinal de unidade de origem do ultrassom. Use uma sonda de alta tensão para monitorar o sinal de saída do amplificador que conduz a fonte de ultrassom durante todo o experimento para garantir que a exposição esteja acontecendo como esperado. E certifique-se de que o osciloscópio está definido para compensar a atenuação da sonda.
O monitoramento do domínio temporal do detector de cavitação passiva revela se os sinais são dimensionados adequadamente para as configurações de instrumentação atuais e se os sinais de cavitação são vistos antes do esperado. O monitoramento de domínio de frequência permite a análise do tipo de comportamento da bolha e pode ser usado para ajustar os níveis de unidade conforme necessário para alcançar o estímulo celular desejado. Nesta análise, na menor pressão incidente, a resposta do detector de cavitação passiva consistiu inteiramente de harmônicos inteiros da frequência de ultrassom fundamental de 0,5MHz.
O aumento de 0,2 para 0,3MPa resultou em ultra harmônicos pronunciados no espectro, além de uma harmônica integer ainda mais elevada. As formas de onda de domínio de tempo nessas duas pressões pareciam semelhantes, embora os resultados do 0.3MPa demonstrassem mais variabilidade durante a duração do pulso. Na maior pressão, a amplitude da forma de onda de domínio do tempo cresceu não linearmente em relação às pressões mais baixas como resultado de ruído de banda larga claramente elevado, provavelmente devido à cavitação inercial causada pela destruição de micro bolhas.
Aqui, espectros completos são mostrados ao longo de um tempo de exposição de 50 segundos durante o qual a fonte emitiu dois pulsos de milissegundo a cada 0,2 segundos. Como observado neste gráfico, ilustrando os correspondentes poderes harmônicos e de banda larga, foram geradas grandes respostas de banda larga de amplitude com o pico inicial considerado correlacionado com a destruição das maiores bolhas. Após alguns segundos, a resposta da banda larga diminui rapidamente, aparentemente devido à destruição da bolha.
Nesta análise, utilizando uma diluição de 20 a 1 de micro bolhas e PBS normal, os espectros médios de tempo e amostra mostraram que o detector de cavitação passiva não focalizado continha uma resposta de banda larga mais forte do que o detector de foco. Acompanhado de uma amostra reduzida à variabilidade amostral tanto nos poderes harmônicos quanto ultra harmônicos. Os efeitos bioinduzidos pela cavitação podem ser avaliados usando técnicas como microscopia de fluorescência, citometria de fluxo ou ensaios biológicos.
Isso permite o estabelecimento de uma relação robusta entre a atividade de cavitação e os efeitos biológicos. Essa técnica nos permitiu identificar melhor as relações entre o comportamento da bolha e os efeitos biológicos que revelaram alguns potenciais novos mecanismos que sustentam a cavitação mediada na entrega de medicamentos.
