Este nuevo protocolo de limpieza de tejidos mejora la tecnología existente para permitir una mirada in vivo más precisa a tipos específicos de células en el corazón y su comportamiento en condiciones de lesión. Este protocolo es rápido y bastante simple. Permite el mantenimiento de la fluorescencia de la marca con interferencia mínima de la fluorescencia automática del tejido del fondo sin requerir la coloración de la célula o del tejido.
Comience usando una gasa empapada de etanol al 70% para limpiar la superficie ventral del ratón experimental. Use tijeras quirúrgicas para hacer una incisión transversal de tres centímetros, aproximadamente tres metros por debajo del proceso xifoides y desglove el ratón desde el abdomen hasta el proceso xifoides para separar la piel del tejido subyacente de la pared abdominal. Haga una incisión transversal de dos centímetros en el tejido subcutáneo de la pared abdominal, tres centímetros por debajo del proceso xifoideo y haga un corte vertical de esta incisión hasta la línea media a través de la caja torácica.
Fije la caja torácica de nuevo para exponer el corazón. Y use una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja calibre 27 para inyectar PBS frío en la vena cava superior y la aorta. Cuando toda la sangre se haya enjuagado del corazón, entregue 10 mililitros de frío al 4% de PFA en la vena cava superior y la aorta para comenzar el proceso de fijación.
Cuando todo el fijador ha sido destellado, extirpar el corazón y utilizar un bisturí de hoja recta para separar las aurículas, ventrículo derecho y tabique y ventrículo izquierdo. Coloque el corazón en un tubo cónico de 15 mililitros de frío 4% PFA para una incubación nocturna a cuatro grados centígrados en un nutator. A la mañana siguiente, agregue una solución de iniciador fotográfico al 0.25% a una solución de hidrogeles recién preparada y transfiera el corazón al gel hidro.
Envuelva el tubo cónico en papel de aluminio para una incubación nocturna a cuatro grados centígrados sin molestias físicas. A la mañana siguiente, caliente el tubo en un baño de cuentas de 37 grados celsius durante 2,5 horas antes de usar las fuerzas para transferir cuidadosamente el corazón a un tubo de PBS de 15 mililitros. Lave el corazón tres veces en PBS durante una hora por lavado a 37 grados centígrados en un nutator y transfiera el corazón a la cesta de una máquina de electroforesis activa.
Asegure la tapa en su lugar y llene el depósito de la cámara de electroforesis activa con una solución de limpieza de electroforesis. Una vez que la cámara esté llena, sumerja la cesta en la solución y apriete la tapa de la máquina de electroforesis en su lugar. Luego ejecute la máquina de electroforesis a 1.5 amperios y 37 grados celsius durante 1.5 horas.
Después de la electroforesis, revise visualmente el corazón para asegurarse de que no quede tejido opaco. Lave el corazón despejado tres veces en un dos de 15 mililitros durante una hora en PBS fresco a 37 grados centígrados por lavado en un nutator. Antes de sumergir el corazón en agente decolorante para reducir la fluorescencia automática del heme.
Después de 48 horas, lave el corazón tres veces en PBS como se ha demostrado y equilibre el corazón en RIMS recién preparado durante 48 horas antes de la toma de imágenes. Para obtener imágenes en 3D del corazón despejado, primero, coloque una capa delgada de grasa de vacío en la parte inferior de un depósito inferior impreso en 3D, la misma altura que la muestra que se está fotografiando. Llene el depósito con RIMS y use una punta de pipeta para eliminar cualquier burbuja.
Coloque cuidadosamente el corazón en las LLANTAS con la pared ventricular izquierda hacia arriba, cuidando de que no se introduzcan burbujas en la solución. Use grasa de vacío para unir un resbalón de cubierta de vidrio a la superficie inferior de una pieza de depósito superior impresa en 3D y coloque las cubiertas del depósito superior en los depósitos inferiores, teniendo cuidado de evitar burbujas. Luego llene los depósitos superiores con glicerol.
Use un microscopio confocal para tomar imágenes de los corazones despejados. La combinación de la limpieza refinada del tejido cardiaco con proyección de imagen 3D permite una visualización detallada avanzada de fibroblastos cardiacos. Usando esta técnica de proyección de imagen, los fibroblastos se observan para ser embalados denso y para tener una morfología spindled en corazones ilesos.
Después de lesión de la reperfusión de la isquemia, una pérdida de fibroblastos cardiacos se considera en la región isquémica por los primeros tres días después de lesión. Para los días siete y 14, los fibroblastos han migrado o proliferado para repoblar el área de tejido lesionado. Para el día 28, la población de fibroblastos cardíacos que rodea las áreas lesionadas del corazón está en su mayor densidad.
Un día y medio después de lesión del infarto del miocardio, pocos fibroblastos permanecen dentro del ventrículo izquierdo dañado. Sin embargo, para el tercer día, los fibroblastos se expanden y están presentes en la mayor parte del ventrículo izquierdo. En contraste con la cirugía isquémica, la infusión de la angiotensina dos y del phenolefrin durante varias semanas no da lugar a pérdida cardiaca del tejido y a la reducción de la pared.
En lugar, el fibroblasto alinea a lo largo del eje del patrón derecho de la contracción de la hélice según lo visto al usar refinado al protocolo del claro del tejido. Además, después de la angiotensina dos y el tratamiento con fenolefrina, los fibroblastos aparecen pequeños y redondeados en comparación con la forma del huso observada en los modelos de reprofusión de isquemia y lesión por infarto de miocardio. El claro electroforético debe realizarse con cuidado, especialmente cuando se trabaja con corazones que se han sometido a protocolos de lesiones.
Este protocolo se puede utilizar para evaluar cómo reaccionan los fibroblastos cardiacos a lesión in vivo. También se pueden utilizar diferentes marcadores fluorescentes para entender cómo responde el corazón a las lesiones a nivel celular.
