Este novo protocolo de limpeza de tecidos melhora a tecnologia existente para permitir um olhar in vivo mais preciso para tipos de células específicas no coração e seu comportamento em condições de lesão. Este protocolo é rápido e bastante simples. Permite a manutenção da fluorescência marca com interferência mínima da fluorescência automática do tecido de fundo sem exigir coloração celular ou tecido.
Comece usando uma gaze de 70% de etanol para limpar a superfície ventral do mouse experimental. Use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão transversal de três centímetros, aproximadamente três metros abaixo do processo xifoide e deglove o rato do abdômen para o processo xifoide para separar a pele do tecido da parede abdominal subjacente. Faça uma incisão transversal de dois centímetros no tecido subcutâneo da parede abdominal, três centímetros abaixo do processo xifoide e faça um corte vertical dessa incisão até a linha média através da caixa torácica.
Fixe a caixa torácica de volta para expor o coração. E use uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha calibre 27 para injetar PBS frio na veia cava superior e aorta. Quando todo o sangue tiver sido lavado do coração, entregue 10 mililitros de 4% de PFA frio na veia cava superior e aorta para iniciar o processo de fixação.
Quando todo o fixador tiver piscado, extirpar o coração e usar um bisturi de lâmina reta para separar o atria, o ventrículo direito e o septo e o ventrículo esquerdo. Coloque o coração em um tubo cônico de 15 mililitros de 4%PFA frio para uma incubação durante a noite a quatro graus celsius em um nutador. Na manhã seguinte, adicione uma solução de iniciador fotográfico de 0,25% a uma solução de hidrogéis recém-preparada e transfira o coração para o gel hidráulico.
Enrole o tubo cônico em papel alumínio para uma incubação durante a noite a quatro graus celsius sem perturbação física. Na manhã seguinte, aqueça o tubo em um banho de contas de 37 graus celsius por 2,5 horas antes de usar fórceps para transferir cuidadosamente o coração para um tubo de 15 mililitros de PBS. Lave o coração três vezes em PBS por uma hora por lavagem a 37 graus celsius em um nutador e transfira o coração para a cesta de uma máquina ativa de eletroforese.
Fixe a tampa no lugar e encha o reservatório ativo da câmara de eletroforese com solução de limpeza de eletroforese. Uma vez que a câmara esteja cheia, submergir a cesta na solução e apertar a tampa da máquina de eletroforese no lugar. Em seguida, execute a máquina de eletroforese a 1,5 amperes e 37 graus celsius por 1,5 horas.
Após a eletroforese, verifique o visual do coração para garantir que nenhum tecido opaco permaneça. Lave o coração limpo três vezes em um 15-mililitro dois por uma hora em PBS fresco a 37 graus celsius por lavagem em um nutador. Antes de submergir o coração em agente descolorante para reduzir a fluorescência automática de heme.
Após 48 horas, lave o coração três vezes em PBS como demonstrado e equilibre o coração em RIMS recém-preparados por 48 horas antes da imagem. Para imagens 3D do coração limpo, primeiro, coloque uma fina camada de graxa de vácuo na parte inferior de um reservatório de fundo impresso em 3D, a mesma altura da amostra que está sendo imageada. Encha o reservatório com RIMS e use uma ponta de pipeta para remover quaisquer bolhas.
Coloque cuidadosamente o coração nas RIMS com a parede ventricular esquerda voltada para cima, cuidando para que nenhuma bolha seja introduzida na solução. Use graxa de vácuo para anexar um deslizamento de tampa de vidro à superfície inferior de uma peça de reservatório impressa em 3D e coloque as tampas do reservatório superior para baixo nos reservatórios inferiores, tomando cuidado para evitar bolhas. Em seguida, encha os reservatórios superiores com glicerol.
Use um microscópio confocal para imaginar os corações limpos. A combinação de limpeza de tecido cardíaco refinado com imagem 3D permite uma visualização detalhada avançada de fibroblastos cardíacos. Usando esta técnica de imagem, os fibroblastos são observados como densamente embalados e com uma morfologia espinhosa em corações ilesos.
Após lesão de reperfusão de isquemia, a perda de fibroblastos cardíacos é vista na região isquêmica nos primeiros três dias após a lesão. Nos dias 7 e 14, os fibroblastos migraram ou proliferaram para repovoar a área do tecido ferido. Até o dia 28, a população de fibroblasto cardíaco em torno das áreas feridas do coração está em sua maior densidade.
Um dia e meio após a lesão no infarto do miocárdio, poucos fibroblastos permanecem dentro do ventrículo esquerdo ferido. No terceiro dia, porém, os fibroblastos se expandem e estão presentes na maior parte do ventrículo esquerdo. Em contraste com a cirurgia isquêmica, a infusão de angiotensina dois e fenolefrin ao longo de várias semanas não resulta em perda de tecido cardíaco e afinamento da parede.
Em vez disso, o fibroblasto se alinha ao longo do eixo do padrão de contração da hélice destro, como visto ao usar o refinado para o protocolo de limpeza tecidual. Além disso, após o tratamento de angiotensina dois e fenozolfrino, os fibroblastos parecem pequenos e arredondados em oposição à forma de fuso observada em modelos de reprofusão isquemia e lesão por infarto do miocárdio. A clareira eletroforética precisa ser realizada cuidadosamente especialmente quando se trabalha com corações que passaram por protocolos de lesão.
Este protocolo pode ser usado para avaliar como os fibroblastos cardíacos reagem à lesão in vivo. Diferentes marcadores fluorescentes também podem ser usados para entender como o coração responde à lesão no nível celular.
