Expresamos nuestra gratitud al grupo del Dr. Eric Olson en UT Southwestern Medical Center por compartir generosamente los modelos animales. Agradecemos todos los comentarios constructivos proporcionados por los miembros de la incubadora D en UT Dallas. Este trabajo fue apoyado por NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) y el programa UT Dallas STARS (Y.D.).

Los protocolos y experimentos con animales han sido aprobados y llevados a cabo bajo la supervisión del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Texas en Dallas (IACUC # 21-03). En este estudio se utilizaron ratones C57BL6, incluidos neonatos en el día postnatal 1 (P1) y adultos de 8 semanas de edad. No se observaron diferencias entre machos y hembras. Toda la adquisición de datos y el post-procesamiento de imágenes se llevaron a cabo utilizando software de código abierto o plataformas con licencias de investigación o educativas. Los recursos están disponibles a través de los autores previa solicitud razonable.
1. Preparación de la muestra y limpieza de tejidos (6 - 10 días)
<ol><li>Prepare todas las soluciones químicas en la Tabla de Materiales requeridas para el método de limpieza de tejidos antes de iniciar el procedimiento de limpieza de tejidos. NOTA: Realice todos los procedimientos en una campana extractora mientras usa el equipo de protección personal adecuado, especialmente cuando manipule productos químicos tóxicos.</li>
	<li>Eutanasiar a los animales con CO2 colocándolos en una cámara de CO2 en los puntos de tiempo deseados, como P1 y 8 semanas, para la recolección de corazón completo y sumergir el corazón recién aislado a temperatura ambiente (RT) en KCl 0,2 M para detenerlo en la diástole16.</li>
	<li>Fije el corazón sumergiéndolo en paraformaldehído (PFA) al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x con una suave agitación en un balancín durante la noche para preservar la anatomía cardíaca a 4 °C, ver Tabla 1. PRECAUCIÓN: El PFA es un producto químico tóxico y debe realizarse bajo una campana extractora.</li>
	<li>Lava el corazón con 1x PBS en RT durante 30 min, 3x. NOTA: Opcional: Incruste el corazón en gel de agarosa para crear un ensamblaje de corazón para el sistema LSM personalizado en el paso 2 como se describe a continuación.<ol><li>Prepare la solución de agarosa al 1% disolviendo agarosa en PBS y caliente la mezcla en el microondas hasta la disolución completa. Vierta la solución en un molde para crear una capa inferior hasta que la solución se enfríe a 40 °C.</li>
		<li>Coloca el corazón en el molde y rellena el molde con gel de agarosa hasta que se solidifique. Elimine cualquier burbuja en el gel de agarosa para minimizar los artefactos en las imágenes. NOTA: La inclusión de la muestra reduce el riesgo de daño potencial a la anatomía del corazón durante el montaje. PRECAUCIÓN: Utilice agarosa de bajo punto de fusión y evite colocar el corazón directamente en agarosa calentada para mitigar el riesgo de exponer la muestra a temperaturas elevadas.</li>
	</ol></li>
	<li>Deshidratar el corazón utilizando gradientes de metanol mezclado con agua desionizada (Figura 1B), procesando a través de concentraciones secuenciales de 20%, 40%, 60%, 80% y 100% como se describe en la Tabla 1. Repita con metanol 100% fresco 1x para asegurar una deshidratación completa. Deshidratar corazones de ratón neonatos durante 1 h en cada mezcla de metanol con agitación. Ajuste el tiempo de incubación a 2 h para corazones de ratón de 8 semanas y corazones de rata. PRECAUCIÓN: El metanol es un producto químico volátil, irritante e inflamable.</li>
	<li>Reemplace y enfríe el corazón con metanol fresco 100% durante 10 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Reemplace la solución y blanquee el corazón con peróxido de hidrógeno al 5% (H2O2) en metanol, utilizando una proporción de volumen de 1:5 (30%H2O2 a 100% metanol) durante la noche a 4 °C para eliminar los pigmentos. NOTA: La eliminación de pigmentos permite minimizar la absorción de fotones, lo que mejora la calidad de la imagen con menos artefactos.</li>
	<li>Reemplace la solución e incube el corazón en metanol al 100% durante 1 h en RT.</li>
	<li>Desapidar el corazón con la solución que contiene 66% de diclorometano (DCM) y 33% de metanol durante 3 h con agitación. Asegúrese de que el corazón se hunda hasta el fondo del vial al final de este paso. De lo contrario, renueve la solución (66% DCM / 33% metanol) y extienda el tiempo de incubación (por ejemplo, 1 hora más) para lograr una delipidación completa. Transfiera el corazón a una solución fresca rápidamente para evitar la desecación, ya que la DCM es altamente volátil. PRECAUCIÓN: Utilice polipropileno o cristalería para el experimento, ya que el DCM no es compatible con el poliestireno.</li>
	<li>Utilice éter dibencílico (DBE) para la coincidencia del índice de refracción (RI = 1,56). En el caso de los corazones de ratón neonatos, el proceso de coincidencia del índice de refracción tarda 2 días, mientras que en el caso de los corazones de ratón de 8 semanas de edad, tarda 5 días con un leve temblor. Reemplácelo con DBE fresco y extienda el tiempo de incubación hasta que el corazón logre una transparencia completa. PRECAUCIÓN: El DBE es peligroso. Evite cualquier contacto con la piel.</li>
</ol>2. Montaje de la muestra (1 día)
NOTA: En caso de que se utilice un sistema LSM comercial, siga su protocolo específico proporcionado por la compañía para reparar el corazón y omita los pasos 2.1 - 2.9.
<ol><li>Personalice una cámara y un soporte resistentes a la solución de adaptación del índice de refracción (por ejemplo, DBE en el enfoque iDISCO adaptado) utilizando una impresora 3D y materiales Onyx (Figura 2A)16.</li>
	<li>Coloque un imán en la parte inferior de la cámara para facilitar una conexión rápida y una localización precisa bajo el sistema LSM (Figura 2B).</li>
	<li>Fije cubreobjetos de 25 mm x 50 mm x 0,17 mm a la cámara con pegamento de silicona transparente y verifique la integridad impermeable de la cámara llenándola con DBE y comprobando si hay fugas después de 1 día.</li>
	<li>Personalice un soporte de abrazadera con una impresora 3D y coloque un imán para montar el conjunto del corazón dentro de la cámara (Figura 2C) o inserte una aguja en el gel de agarosa para montar el conjunto del corazón.</li>
	<li>Llevar a cabo el desarrollo de un sistema LSM interno utilizando una lente cilíndrica y láseres de estado sólido bombeados por diodo de onda continua (DPSS) como se informó anteriormente16,22. Utilice la longitud de onda de excitación de 532 nm para capturar la autofluorescencia del miocardio (Figura 2D).</li>
	<li>Monte la cámara en una plataforma de 6 dimensiones y ubique la posición óptima donde la cámara sea perpendicular a la dirección de propagación del láser.</li>
	<li>Utilice un soporte de abrazadera magnética para colocar la muestra en el centro de la cámara y conecte el soporte a una etapa motorizada de 4 dimensiones (X, Y, Z y guiñada; Figura 2D).</li>
	<li>Sumerja el conjunto del corazón en la cámara llena de DBE utilizando la platina motorizada y determine el rango de escaneo a lo largo del eje de detección (dirección Z).</li>
	<li>Determine la velocidad de escaneo (Vz) del motor a lo largo de la dirección Z en función del tamaño del paso (S) y el tiempo de adquisición de una imagen (T) utilizando la siguiente ecuación: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66707/66707eq01.jpg" style="margin: auto;"> NOTA: La relación entre el tamaño del paso y la resolución axial del sistema de imágenes se adhiere al teorema de muestreo de Nyquist-Shannon. Por ejemplo, el tamaño del paso se fijó en 1 μm, dado que la resolución axial era de 2,91 μm, como se indicó en el informe anterior16.</li>
	<li>Para verificar la resolución espacial y minimizar los posibles problemas de opacidad a diferentes profundidades, mida la función de dispersión puntual (PSF) del sistema mediante la obtención de imágenes de perlas fluorescentes con un diámetro de 0,53 μm diluidas en gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1% con una concentración de 1:1,5 x 105. Calcule la PSF en toda la muestra midiendo el ancho completo a la mitad del máximo (FWHM)16.</li>
</ol>3. Costura de imágenes (4-8 h)
<ol><li>Calcule el número de fichas necesarias para cubrir todo el corazón del ratón, teniendo en cuenta el campo de visión limitado. Para cada baldosa, las dimensiones corresponden al campo de visión del sistema LSM. Por ejemplo, un corazón de ratón neonatal con una medida de sección transversal de 3 x 3,6mm2 necesita 2 x 2 mosaicos para la cobertura en el LSM personalizado (Figura 3A). Por el contrario, un corazón de ratón de 8 semanas de edad que mide 5 x 8mm2 requiere 3 x 4 baldosas para cubrir toda la estructura cardíaca (Figura 3B). NOTA: La unión de imágenes es necesaria si el LSM convencional tiene un campo de visión limitado para obtener imágenes de todo el corazón.</li>
	<li>Capture imágenes del corazón a partir de la ficha 1, es decir, la ficha de la esquina superior izquierda del corazón (Figura 3A-B).</li>
	<li>Capture secuencialmente imágenes de las baldosas restantes con una superposición del 10% entre baldosas consecutivas hasta que se cubra todo el corazón, como se ilustra en la Figura 3C.</li>
	<li>Descargue e instale el software de código abierto Fiji23 . Descargue e instale el complemento de Fiji, BigStitcher24.</li>
	<li>Vaya al menú Ayuda, seleccione Actualizar, elija Administrar sitio de actualización y opte por BigStitcher. A continuación, haga clic en Cerrar, seguido de Aplicar cambios. Al completar la descarga del complemento, reinicie el software Fiji.</li>
	<li>Abra el complemento BigStitcher e importe todos los mosaicos necesarios a través del directorio de archivos de imagen. Guarde el conjunto de datos como un archivo HDF5.</li>
	<li>Organice las fichas eligiendo Mover ficha por cuadrícula normal, seleccione el patrón que se utiliza para mover el corazón y seleccione una superposición del 10% entre cada ficha. Cose las baldosas con la opción Asistente de costura.</li>
	<li>Exporte los datos unidos mediante Image Fusion para generar un archivo tiff.</li>
</ol>4. Deconvolución multivista (5 días)
<ol><li>Utilice perlas fluorescentes para el registro de imágenes de la reconstrucción multivista a lo largo del corazón (Figura 3D).<ol><li>Prepare la resina25 mezclando éter diglicidílico de bisfenol-A (D.E.R. 332), isoforona diamina, 5-amino-1,3,3-trimetilciclohexanemetilamina (IPDA) y éter diglicidílico de polipropilenglicol (D.E.R 736) en una proporción de volumen de 4:1:1.</li>
		<li>Centrifugar 10 μL de perlas de fluorescencia a 161 x g durante 5 min y añadir 20 μL de metanol para sustituir la solución de almacenamiento de las perlas. Repítelo 3 veces.</li>
		<li>Prepare una solución de 10 ml con una concentración de perlas de 1:1 x 105 mezclando la solución de perlas a base de metanol con la resina preparada en el paso 4.1.1.</li>
		<li>Desgasifique la solución en una cámara de vacío durante 3 h para eliminar las bolsas de aire y las burbujas.</li>
		<li>Vierta la solución en un molde de silicona o una pajita de plástico y espere de 2 a 3 días hasta que se solidifique. Después de 1 día antes de que la resina se solidifique, coloque el tubo de vidrio dentro del molde y espere hasta que el tubo se adhiera a la resina. Retire la resina del molde con el tubo de vidrio (Figura 3D).</li>
		<li>Coloque el corazón en el tubo de vidrio, llénelo con DBE y monte el tubo de vidrio en la cámara llena de DBE.</li>
	</ol></li>
	<li>Capture imágenes secuenciales del corazón del ratón junto con las cuentas de la sección iluminada escaneando el conjunto del corazón a través del eje de detección (eje Z; Figura 3E-F). NOTA: Implemente la unión de imágenes en el paso 3 para generar pilas individuales de imágenes si el tamaño del corazón supera el campo de visión.</li>
	<li>Gire el corazón del mouse 60° a lo largo del eje Y para capturar las pilas posteriores desde múltiples ángulos, es decir, 0°, 60°, 120°, 180°, 240° y 300° (Figura 3E-F).</li>
	<li>Abra el complemento BigStitcher e importe todas las imágenes a través del directorio de archivos de imagen. Guarde el conjunto de datos como un archivo HDF5.</li>
	<li>Elija Detectar puntos de interés y seleccione manualmente las cuentas de interés para el registro.</li>
	<li>Seleccione Modelo de transformación afín para el registro. Elija la función de dispersión de puntos y asigne PSF a todas las vistas.</li>
	<li>Haga clic en Deconvolución multivista y elija el tipo de iteración como Bayesiano eficiente. Defina Número de iteraciones como 10 y ejecútelo26.</li>
	<li>Haga clic en Image Fusion para exportar un archivo tiff . NOTA: Se puede encontrar información más detallada sobre la deconvolución multivista en otros informes o protocolos 24,27,28.</li>
</ol>5. Herrajes del sistema de lámina de luz de barrido axial (1 día)
<ol><li>Instale una lente eléctrica sintonizable (ETL) en el plano de Fourier de la lente cilíndrica (CL)27 (Figura 2D) para escanear el rayo láser axialmente14. Asegúrese de que la interfaz líquida en ETL sea horizontal para evitar la distorsión del frente de onda causada por la gravedad. Alinee el ETL con precisión para minimizar el descentramiento del haz y las aberraciones ópticas de orden superior30.</li>
	<li>Instale una tarjeta DAQ en la estación de trabajo y conecte un cable BNC a la tarjeta DAQ para sincronizar la exposición de la cámara y el escaneo ETL.</li>
	<li>Abra la carcasa del controlador ETL y retire la cubierta (Figura 4).</li>
	<li>Suelde el cable de señal del cable BNC al pin de entrada analógica B, como se indica en la parte inferior de la placa PCB (Figura 4).</li>
	<li>Suelde el cable de tierra del cable BNC al pin GND; después de eso, conecte el otro extremo del cable BNC a AO (salida analógica) en la tarjeta DAQ (Figura 4).</li>
	<li>Conecte el controlador ETL al puerto USB de la estación de trabajo, conecte el controlador al ETL mediante un cable hirose e instale el software del controlador del controlador de lentes.</li>
	<li>Cambie el modo de operación en el software del controlador del controlador de lente a analógico para controlar el ETL con un disparador generado desde la tarjeta DAQ.</li>
	<li>En el software de la cámara sCMOS, cambie el modo de captura a Externo (hoja de luz). Asegúrese de que la dirección de escaneo de píxeles activos sea perpendicular a la dirección de escaneo láser para ayudar a la sincronización.</li>
	<li>Conecte el puerto de disparo externo en la parte posterior de la cámara sCMOS al AO de la tarjeta DAQ mediante un cable BNC (Figura 4).</li>
</ol>6. Sincronización del sistema de lámina de luz de barrido axial (7 días)
<ol><li>Defina el tiempo de exposición en función de la relación señal-fondo (SBR) aceptable que, para el estudio propuesto, es de al menos 10. Aumente el tiempo de exposición si el SBR es inferior a 10. NOTA: El tiempo de exposición que oscila entre 10 y 50 ms proporciona un SBR aceptable en este proyecto.</li>
	<li>Defina el tiempo de adquisición de una imagen (T) y el intervalo de línea (L) en función del tiempo de exposición (E) para la cámara y la frecuencia ETL (f) utilizando las siguientes ecuaciones: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66707/66707eq02.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66707/66707eq03.jpg" style="margin: auto;"> Donde P indica el número de columnas de píxeles en el sensor de la cámara. Los parámetros representativos para la referencia son f = 1 Hz, P = 2048, E = 10 ms y L = 243 μs, respectivamente.</li>
	<li>En el programa Trigger Generator.vi de LabVIEW, genera disparadores cuadrados y triangulares para la sincronización (Figura 5). NOTA: El programa personalizado de LabVIEW está disponible a través de los autores previa solicitud razonable.</li>
	<li>Monte perlas fluorescentes diluidas en gel de agarosa16 de bajo punto de fusión al 1% con una concentración de 1:1 x 103 para ubicar la posición de la cintura del haz en la imagen (Figura 6A).</li>
	<li>En el programa, identifique los puntos de inicio y finalización del rayo láser bajo el campo de visión cambiando el voltaje a lo largo de la dirección de escaneo.</li>
	<li>Para sincronizar la cámara sCMOS y ETL, escanee el rayo láser a lo largo del eje X y los píxeles activos a lo largo del eje Y para generar una imagen 2D (Figura 6B). Las perlas más brillantes y nítidas a lo largo de la diagonal de la imagen indican la sincronización precisa entre el sCMOS y el ETL. NOTA: La sincronización de la velocidad de escaneo de la activación de píxeles ETL y sCMOS es fundamental para la calidad de la imagen. En la Figura 6C-F se resumen varios errores asincrónicos comunes.</li>
	<li>Después de determinar los parámetros de sincronización óptimos para la sincronización, gire la cámara sCMOS 90° alrededor del eje Z para alinear la dirección del píxel activo con la dirección del escaneo láser.</li>
	<li>Repita el paso 2.10 y mida el FWHM de la PSF. Utilice el mismo método que se indicó en el informe anterior16, con las resoluciones lateral y axial promediadas de ASLM como 2,18 μm y 2,88 μm, respectivamente (Figura 7). NOTA: La iluminación y la resolución uniformes en todo el campo de visión son factibles en condiciones ideales (Figura 7A-B). El funcionamiento asíncrono del ETL con la cámara sCMOS, así como la desalineación de la iluminación y la detección, pueden dar lugar a una resolución espacial no uniforme (Figura 7C-D).</li>
	<li>Para las imágenes cardíacas, después de alinear el sistema y determinar los parámetros óptimos para la sincronización del sistema, continúe con los pasos 2.6 a 2.9.</li>
</ol>

Microscopía de lámina de luz y limpieza de tejidos para obtener imágenes cardíacas completas

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

El avance de los métodos de imagen, computación y limpieza de tejidos ha brindado una oportunidad sin precedentes para investigar exhaustivamente la estructura y función cardíaca. Esto tiene un gran potencial para profundizar nuestra comprensión de la morfogénesis y la patogénesis cardíaca utilizando un modelo de corazón de roedor intacto. A diferencia de los estudios in vivo del corazón del pez cebra que utilizan un enfoque similar 40,41,42,43, la integración de técnicas avanzadas de LSM y métodos ...

La insuficiencia cardíaca sigue siendo la principal causa de mortalidad en todo el mundo, principalmente debido a la falta de capacidad regenerativa de los cardiomiocitos maduros1. La intrincada arquitectura del corazón desempeña un papel crucial en su función y proporciona información sobre los procesos de desarrollo. Una comprensión profunda de la estructura cardíaca es esencial para dilucidar los procesos fundamentales de la morfogénesis y la remodelación cardíaca en respuesta al infarto de miocardio. Avances recientes han demostrado que los ratones neonatos pueden restaurar la función cardíaca después de una lesión, mientras que los ratones adultos carecen dedicha capacidad regenerativa. Esto establece una base para investigar las señales asociadas con anomalías estructurales y funcionales en modelos de ratón. Los métodos de imagen tradicionales, como la microscopía confocal, tienen limitaciones técnicas, incluida la profundidad de penetración restringida, el esquema de escaneo de punto lento y el daño fotográfico por la exposición prolongada a la luz láser. Esto dificulta la obtención de imágenes tridimensionales (3D) completas del corazón intacto. En este contexto, la microscopía de lámina óptica (LSM) surge como una solución poderosa, que ofrece las ventajas de la obtención de imágenes de alta velocidad, la reducción del daño fotográfico y las capacidades excepcionales de corte óptico 3,4,5. Las características únicas de la LSM lo posicionan como un método prometedor para superar las limitaciones de las técnicas convencionales, proporcionando conocimientos sin precedentes sobre el desarrollo cardíaco y los procesos de remodelación 6,7,8.
En este protocolo, introducimos una estrategia de imagen que combina LSM avanzado con enfoques de limpieza de tejidos adaptados9, lo que permite la obtención de imágenes de corazones de ratón completos sin la necesidad de un etiquetado específico y un corte mecánico. Además, proponemos que las imágenes convencionales de LSM se pueden mejorar a través de técnicas de deconvolución multivista10 o microscopía de lámina de luz de barrido axial (ASLM) 11,12,13,14,15 para mejorar la resolución axial. Además, la integración de la unión de imágenes con cualquiera de estos métodos puede superar eficazmente el equilibrio entre la resolución espacial y el campo de visión (FOV), avanzando así en la obtención de imágenes de corazones de ratón adultos. La incorporación de numerosos enfoques de limpieza de tejidos, incluidos los métodos hidrofóbicos, hidrófilos y basados en hidrogel, permite una penetración más profunda de la luz para capturar la morfología de todo el corazón 16,17,18,19.
Si bien los múltiples métodos de eliminación son compatibles con los sistemas LSM actuales, el objetivo es minimizar la dispersión de fotones y mejorar la penetración de la luz en los tejidos, como el corazón, reemplazando los lípidos con un medio que coincida estrechamente con su índice de refracción. iDISCO fue elegido como el representativo20,21 y adaptado para la obtención de imágenes de autofluorescencia en este protocolo debido a su rápido procesamiento y alta transparencia (Figura 1A). En conjunto, la integración del enfoque avanzado de LSM con las técnicas de limpieza de tejidos ofrece un marco prometedor para desentrañar la intrincada anatomía cardíaca en corazones de roedores, con un potencial significativo para avanzar en nuestra comprensión de la morfogénesis y la patogénesis cardíacas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for tissue clearing&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>118184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.E.R.&#8482; 332</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.E.R.&#8482; 736</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether (DBE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>FP-0556-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>47392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2021.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigStitcher</td>
			<td>H&#246;rl et al.22</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji-ImageJ</td>
			<td>Schindelin et al.20</td>
			<td>1.54f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImage Live</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>4.6.1.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments Corporation</td>
			<td>2017 SP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Key components of the customized light-sheet system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.63 - 6.3X Zoom body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX-ZB10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Illumination objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH00105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X detection objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MV PLAPO 1X/0.25&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>473nm DPSS Laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0473-PFM-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532nm DPSS laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0532-PFM-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>589&#8201;nm DPSS laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0589-GFF-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC connector</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>BNC-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACY254-050-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC-Motor Controller, 4 axes</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>C-884.4DC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL Cable</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>CAB-6-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL Lens Driver</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-E-4i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET525/30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET585-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET645-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel&#160;</td>
			<td>Shutter Instrument</td>
			<td>LAMBDA 10-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>L-406.20DG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>L-406.40DG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>M-403.4PD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NI multifunction I/O</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>PCIe-6363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper motor</td>
			<td>Pololu</td>
			<td>1474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX-TLU</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet imaging to reveal cardiac structure in rodent hearts

La microscopía de lámina óptica (LSM) desempeña un papel fundamental en la comprensión de la intrincada estructura tridimensional (3D) del corazón, proporcionando información crucial sobre la fisiología cardíaca fundamental y las respuestas patológicas. A continuación, profundizamos en el desarrollo e implementación de la técnica LSM para dilucidar la microarquitectura del corazón en modelos de ratón. La metodología integra un sistema LSM personalizado con técnicas de limpieza de tejidos, mitigando la dispersión de la luz dentro de los tejidos cardíacos para la obtención de imágenes volumétricas. La combinación de LSM convencional con costura de imágenes y enfoques de deconvolución multivista permite la captura de todo el corazón. Para abordar la compensación inherente entre la resolución axial y el campo de visión (FOV), introducimos un método de microscopía de lámina de luz de barrido axial (ASLM) para minimizar la luz desenfocada e iluminar uniformemente el corazón en toda la dirección de propagación. Mientras tanto, los métodos de limpieza de tejidos, como iDISCO, mejoran la penetración de la luz, lo que facilita la visualización de estructuras profundas y garantiza un examen exhaustivo del miocardio en todo el corazón. La combinación de los métodos de LSM y limpieza de tejidos propuestos presenta una plataforma prometedora para los investigadores en la resolución de estructuras cardíacas en corazones de roedores, con un gran potencial para la comprensión de la morfogénesis y la remodelación cardíaca.

Heart failure remains the leading cause of mortality worldwide, primarily due to the lack of regenerative capacity of mature cardiomyocytes1. The intricate architecture of the heart plays a crucial role in its function and provides insights into developmental processes. A profound understanding of cardiac structure is essential for elucidating the fundamental processes of cardiac morphogenesis and remodeling in response to myocardial infarction. Recent progress has demonstrated that neonatal mice can restore cardiac function following injury, while adult mice lack such regenerative capacity2. This establishes a foundation for investigating cues associated with structural and functional abnormalities in mouse models. Traditional imaging methods, such as confocal microscopy, have technical limitations, including restricted penetration depth, slow point-scanning scheme, and photo damage from prolonged exposure to laser light. These hinder comprehensive three-dimensional (3D) imaging of the intact heart. In this context, light-sheet microscopy (LSM) emerges as a powerful solution, offering the advantages of high-speed imaging, reduced photo damage, and exceptional optical sectioning capabilities3,4,5. The unique features of LSM position it as a promising method to overcome the limitations of conventional techniques, providing unprecedented insights into cardiac development and remodeling processes6,7,8.
In this protocol, we introduce an imaging strategy that combines advanced LSM with adapted tissue clearing approaches9, allowing for the imaging of entire mouse hearts without the need for specific labeling and mechanical sectioning. We further propose that conventional LSM imaging can be enhanced through multiview deconvolution10 or axially swept light-sheet microscopy (ASLM) techniques11,12,13,14,15 to improve axial resolution. Additionally, the integration of image stitching with either of these methods can effectively overcome the trade-off between spatial resolution and field of view (FOV), thereby advancing the imaging of adult mouse hearts. The incorporation of numerous tissue clearing approaches, including hydrophobic, hydrophilic, and hydrogel-based methods, enables deeper light penetration for capturing the morphology of the entire heart16,17,18,19.
While multiple clearing methods are compatible with current LSM systems, the goal is to minimize photon scattering and enhance light penetration in tissues, like the heart, by replacing lipids with a medium that closely matches its refractive index. iDISCO was chosen as the representative20,21 and adapted for autofluorescence imaging in this protocol due to its rapid processing and high transparency (Figure 1A). Collectively, the integration of the advanced LSM approach with tissue clearing techniques offers a promising framework to unravel intricate cardiac anatomy in rodent hearts, holding significant potential for advancing our understanding of cardiac morphogenesis and pathogenesis.

Autor destacado: Imágenes personalizadas de lámina de luz para investigar estructuras miocárdicas en corazones de roedores

Imágenes con lámina de luz para revelar la estructura cardíaca en corazones de roedores

Our research aims at customizing a light-sheet imaging system to investigate the myocardial structures of the intact rodent heart at a cellular level. We have developed a workflow to explore the intact myocardium with isotropic resolution at the micron level from neonatal to adult rodent hearts. Our study fills a gap in investigating the intricate myocardial microstructures, such as trabeculation, inside the intact ventricles, with high spatial resolution.This imaging strategy provides an entry point to assess microstructure without physical slicing, leading to an enhanced understanding of cardiac development and remodeling. We will concentrate on exploring the structural changes of the myocardium in response to cardiac injury and remodeling.

Se ha demostrado que la LSM fomenta los estudios cardíacos 31,32,33,34,35,36,37 debido al riesgo mínimo de daño fotográfico, alta resolución espacial y seccionamiento óptico en comparación con otros métodos de imagen óptica como las técnicas de campo claro y escaneo puntual <sup c...

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El protocolo utiliza microscopía avanzada de lámina de luz junto con métodos de limpieza de tejidos adaptados para investigar estructuras cardíacas intrincadas en corazones de roedores, con un gran potencial para la comprensión de la morfogénesis y la remodelación cardíaca.

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

Nuestra investigación tiene como objetivo personalizar un sistema de imágenes de lámina de luz para investigar las estructuras miocárdicas del corazón intacto de un roedor a nivel celular. Hemos desarrollado un flujo de trabajo para explorar el miocardio intacto con resolución isotrópica a nivel de micras desde el corazón de roedores neonatos hasta adultos. Nuestro estudio llena un vacío en la investigación de las intrincadas microestructuras miocárdicas, como la trabeculación, dentro de los ventrículos intactos, con alta resolución espacial.Esta estrategia de imagen proporciona un punto de entrada para evaluar la microestructura sin corte físico, lo que conduce a una mejor comprensión del desarrollo y la remodelación cardíaca. Nos concentraremos en explorar los cambios estructurales del miocardio en respuesta a la lesión cardíaca y la remodelación.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

578 vistas.  The University of Texas at Dallas. Nuestra investigación tiene como objetivo personalizar un sistema de imágenes de lámina de luz para investigar las estructuras miocárdicas del corazón intacto de un roedor a nivel celular. Hemos desarrollado un flujo de trabajo para explorar el miocardio intacto con resolución isotrópica a nivel de micras desde el corazón de roedores neonatos hasta adultos. Nuestro estudio llena un vacío en la investigación de las intrincadas microestructuras miocárdicas, como la trabeculación, de...

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Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights into fundamental cardiac physiology and pathologic responses. We hereby delve into the development and implementation of the LSM technique to elucidate the micro-architecture of the heart in mouse models. The methodology integrates a customized LSM system with tissue clearing techniques, mitigating light scattering within cardiac tissues for volumetric imaging. The combination of conventional LSM with image stitching and multiview deconvolution approaches allows for the capture of the entire heart. To address the inherent trade-off between axial resolution and field of view (FOV), we further introduce an axially swept light-sheet microscopy (ASLM) method to minimize out-of-focus light and uniformly illuminate the heart across the propagation direction. In the meanwhile, tissue clearing methods such as iDISCO enhance light penetration, facilitating the visualization of deep structures and ensuring a comprehensive examination of the myocardium throughout the entire heart. The combination of the proposed LSM and tissue clearing methods presents a promising platform for researchers in resolving cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

The protocol utilizes advanced light-sheet microscopy along with adapted tissue clearing methods to investigate intricate cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.