Bu yeni doku temizleme protokolü, kalpteki belirli hücre tiplerine ve yaralanma koşullarındaki davranışlarına daha doğru bir in vivo bakış sağlamak için mevcut teknolojiyi geliştirir. Bu protokol hızlı ve oldukça basittir. Hücre veya doku lekesi gerektirmeden arka plan dokusu oto floresanından minimum parazitle marca floresanının korunmasına izin verir.
Deneysel farenin ventral yüzeyini temizlemek için% 70 etanol ıslatılmış gazlı bez ped kullanarak başlayın. Xiphoid işleminin yaklaşık üç metre altında üç santimetre enine kesi yapmak için cerrahi makas kullanın ve cildi alttaki karın duvarı dokusundan ayırmak için fareyi karından xiphoid işlemine deglove edin. Deri altı karın duvarı dokusunda, xiphoid işleminin üç santimetre altında iki santimetrelik enine bir kesi yapın ve bu kesiden göğüs kafesinden orta çizgiden dikey bir kesik yapın.
Kalbi açığa çıkarmak için göğüs kafesini geriye sabitle. Ve üstün vena kava ve aort içine soğuk PBS enjekte etmek için 27 gauge iğne ile donatılmış 10 mililitrelik bir şırınga kullanın. Tüm kan kalpten temizlendiğinde, sabitleme işlemine başlamak için üstün vena kava ve aort içine 10 mililitre soğuk% 4 PFA teslim edin.
Tüm fiksatif yanıp söndüğünde, kalbi kesin ve atria, sağ ventrikül ve septum ve sol ventrikülü ayırmak için düz bir bıçak neşteri kullanın. Bir fındık makinesinde dört santigrat derecede bir gecede inkübasyon için kalbi 15 mililitrelik konik bir soğuk % 4 PFA tüpüne yerleştirin. Ertesi sabah, yeni hazırlanmış bir hidrojel çözeltisine% 0.25 fotoğraf başlatıcı çözelti ekleyin ve kalbi hidro jele aktarın.
Konik tüpü, fiziksel rahatsızlık olmadan dört santigrat derecede bir gece inkübasyonu için folyoya sarın. Ertesi sabah, kalbi 15 mililitrelik bir PBS tüpüne dikkatlice aktarmak için forseps kullanmadan önce tüpü 2,5 saat boyunca 37 santigrat derece boncuk banyosunda ısıtın. Kalbi PBS'de bir saat boyunca bir besleyicide 37 santigrat derecede yıkayın ve kalbi aktif bir elektroforezi makinesinin sepetine aktarın.
Kapağı yerine sabitleyin ve aktif elektroforez odası haznesini elektroforez temizleme çözeltisi ile doldurun. Oda dolduğunda, sepeti çözeltiye batırın ve elektroforezi makinesinin kapağını yerine sıkın. Daha sonra elektroforezi makinesini 1,5 saat boyunca 1,5 amper ve 37 santigrat derecede çalıştırın.
Elektroforeziden sonra, opak doku kalmadığından emin olmak için kalbin görsel olarak kontrol edin. Temizlenmiş kalbi 15 mililitrelik ikide üç kez bir saat boyunca taze PBS'de bir besleyicide yıkama başına 37 santigrat derecede yıkayın. Heme oto floresanını azaltmak için kalbi renksizleştirme ajanına batırmadan önce.
48 saat sonra, kalbi pbs'de gösterildiği gibi üç kez yıkayın ve görüntülemeden önce 48 saat boyunca yeni hazırlanmış RIMS'de kalbi aşındırın. Temizlenmiş kalbin 3D görüntülenmesi için, önce, 3D baskılı bir alt haznenin altına, numunenin görüntülendiği yükseklikte ince bir vakum yağı tabakası yerleştirin. Rezervuarı RIMS ile doldurun ve kabarcıkları çıkarmak için bir pipet ucu kullanın.
Sol ventrikül duvarı yukarı bakacak şekilde kalbi RIMS'e dikkatlice yerleştirin, çözeltiye kabarcık sokulmamalarına dikkat edin. 3D baskılı üst rezervuar parçasının alt yüzeyine bir cam kapak kayması takmak için vakum gresi kullanın ve üst rezervuar kapaklarını kabarcıklardan kaçınmaya dikkat ederek alt rezervuarlara yerleştirin. Daha sonra üst rezervuarları gliserol ile doldurun.
Temizlenmiş kalpleri görüntülemek için bir konfokal mikroskop kullanın. Rafine kardiyak doku temizlemeyi 3D görüntüleme ile birleştirmek, kardiyak fibroblastların gelişmiş ayrıntılı bir şekilde görselleştirilmesini sağlar. Bu görüntüleme tekniği kullanılarak fibroblastların yoğun bir şekilde paketlendiği ve yaralanmamış kalplerde iğdelenmiş morfolojiye sahip olduğu gözlenir.
İskemi reperfüzyonu yaralanmasından sonra, yaralanmadan sonraki ilk üç gün iskemik bölgede kardiyak fibroblast kaybı görülür. 7. ve 14. 28. güne gelindiğinde, kalbin yaralı bölgelerini çevreleyen kardiyak fibroblast popülasyonu en büyük yoğunluktadır.
Miyokard enfarktüsü yaralanmasından bir buçuk gün sonra, yaralı sol ventrikülde az sayıda fibroblast kalır. Ancak üçüncü güne gelindiğinde, fibroblastlar genişler ve sol ventrikülün çoğunda bulunur. İskemik cerrahinin aksine, anjiyotensin iki ve fenolefrinin birkaç hafta boyunca infüzyonu kalp dokusu kaybına ve duvar incelmesine neden olmaz.
Bunun yerine, fibroblast, rafine edilmiş doku temizleme protokolünü kullanırken görüldüğü gibi sağ el sarmal kasılma deseninin ekseni boyunca hizalanır. Ek olarak, anjiyotensin iki ve fenolefrin tedavisinden sonra, fibroblastlar iskemi reprofüzyonu ve miyokard enfarktüs yaralanması modellerinde gözlenen iğ şeklinin aksine küçük ve yuvarlak görünür. Elektroforetik temizlemenin özellikle yaralanma protokollerinden geçmiş kalplerle çalışırken dikkatli bir şekilde yapılması gerekir.
Bu protokol, kardiyak fibroblastların in vivo yaralanmaya nasıl tepki verdiklerini değerlendirmek için kullanılabilir. Kalbin yaralanmaya hücresel düzeyde nasıl tepki verdiğini anlamak için farklı floresan belirteçler de kullanılabilir.
