Las imágenes de células vivas de matrices unicelulares llamadas LISCA también son una lectura automatizada de los cursos de tiempo fluorescentes de cientos de células individuales. La ventaja del enfoque es que las respuestas de las células individuales se registran a partir de células aisladas espacialmente en micro ambientes idénticos, lo que permite un análisis de emisiones eficiente con grandes estadísticas. Para fabricar una matriz unicelular, utilice un bisturí para cortar una sola obra maestra de PDMs que contiene seis micro rayas de polvo de la capa de PDMs, y coloque la obra maestra en el banco de laboratorio con el patrón micro hacia arriba.
Utilice una cuchilla de afeitar para cortar cada una de las seis rayas de micropatrón en un sello de PDMs, cortando algunas de las áreas estampadas para asegurarse de que los bordes del sello están abiertos. A continuación, raye cuidadosamente la lámina protectora del deslizamiento de la cubierta de una corredera de seis cámaras para marcar las posiciones del canal de la corredera y coloque la hoja de la cubierta en el banco con la lámina protectora hacia abajo. Utilice pinzas para colocar los sellos en el resbalón de la cubierta en las posiciones de canal marcadas, con los micro patrones hacia abajo, y compruebe la fijación de los sellos bajo un microscopio.
Los cuadrados en contacto con la diapositiva aparecerán más oscuros que el interespacio. La calidad del patrón se reduce por los cuadrados que no están correctamente unidos a la diapositiva. Si los sellos se han unido de forma segura tratar el resbalón de la cubierta y los sellos con plasma de oxígeno a 0,2 milibares de presión y aproximadamente 40 vatios durante tres minutos para hacer que las superficies entre los sellos PDMs y la cubierta se deslicen hidrofílicas.
Al final de la limpieza por plasma, coloque el resbalón de la cubierta en un gabinete de bioseguridad y agregue 15 microlitros de solución de poli-l-lisina pegilada a cada sello para que la solución se absorba en el patrón hidrofílico del sello. Después de 20 minutos, enjuague los sellos con un mililitro de agua ultrapura. Use pinzas para quitar los sellos del portaobjetos y enjuague el resbalón de la cubierta por segunda vez con un segundo mililitro de agua ultrapura.
Cuando el resbalón de la cubierta se haya secado por completo, coloque una diapositiva pegajosa de seis canales al resguardo de la cubierta, teniendo cuidado de que las áreas micro estampadas se alineen con la parte inferior de los canales. Y añadir 40 microlitros de PBS y 40 microlitros de solución de fibronectina a cada canal. Para mezclar las dos soluciones, retire 40 microlitros de un depósito y añádalo al depósito opuesto del mismo canal tres veces para generar una solución homogénea.
Cuando todos los canales se hayan mezclado, incube la diapositiva durante 45 minutos a temperatura ambiente antes de lavar cada canal tres veces con 120 microlitros de PBS por lavado. Cambie el PBS a 37 grados Celsius, completamente complementado el medio de crecimiento celular en los canales mediante la adición de 120 microlitros de medio a un depósito y retírelo del depósito opuesto. Añadir 40 microlitros de una suspensión de 400,000 células por mililitro de interés y 40 microlitros de medio de crecimiento celular a cada canal, y mezclar la solución celular con el medio como se demuestra.
Después de mezclar, retire 40 microlitros de suspensión de cada canal para que solo los canales estén llenos de suspensión celular, y coloque el portaobjetos en una incubadora de cultivo celular. Después de una hora, compruebe si hay adherencia celular por microscopía de contraste de fase y agregue 120 microlitros de medio de crecimiento celular de 37 grados Celsius a cada canal, luego devuelva el portaobjetos a la incubadora de cultivos celulares durante tres horas más. Para configurar un sistema de perfusión, conecte una jeringa de un mililitro llena de medio de crecimiento celular de 37 grados Celsius al tubo de entrada del sistema y use la válvula para llenar el tubo con medio.
Conecte el tubo de entrada al depósito de un canal, teniendo cuidado de que no haya burbujas de aire atrapadas, y conecte un conector serie al depósito opuesto al tubo de entrada del canal actual. Conecte el resto de los canales como se muestra hasta que el número requerido de canales estén conectados en serie. Y conecte el tubo de salida directamente al depósito libre del canal final.
A continuación, rellene el tubo conectado con un medio para confirmar que el sistema de perfusión no tiene fugas. Para las imágenes de lapso de tiempo de las células, para establecer un protocolo de lapso de tiempo para registrar una imagen de contraste de fase y una imagen de fluorescencia, establezca la configuración óptica para imágenes de contraste de fase y imágenes de fluorescencia. Utilice un objetivo de 10 veces, los filtros de fluorescencia apropiados y un sistema automatizado de corrección de enfoque para garantizar una mejor calidad de imagen para las mediciones a largo plazo.
Seleccione un tiempo de exposición de 10 milisegundos para la imagen de contraste de fase y un tiempo de exposición de 750 milisegundos para registrar la intensidad de fluorescencia de EGFP. Establezca una programación de tiempo con un intervalo de tiempo de 10 minutos entre los bucles consecutivos a través de la lista de posiciones y un tiempo de observación de 30 horas. A continuación, coloque el portaobjetos de seis canales en la única bodega de izamiento en el soporte de la muestra de la cámara de calentamiento de 37 grados Celsius del microscopio y pegue el tubo del sistema de perfusión al escenario.
Inserte los extremos libres de los tubos de salida en un tubo cónico de 15 mililitros para recoger los residuos líquidos. Y establezca la lista de posiciones para la medición del lapso de tiempo de escaneo, teniendo cuidado de que el número de posiciones pueda escanearse dentro del intervalo de tiempo definido entre bucles consecutivos a través de la lista de posiciones. A continuación, inicie la medición del lapso de tiempo.
Para la transfección de las células con un marcador fluorescente, use una jeringa para enjuagar el sistema de tubos con un mililitro de PBS de 37 grados Celsius, teniendo cuidado de que la etapa del microscopio no se mueva. Después del lavado, llene el sistema con 300 microlitros de medio reducido sérico suplementado con el ARNm de interés, hasta una concentración final de 0,5 nanogramos de ARNm por microlitro, y permita que los lipoplexos se incuben durante una hora. Al final de la incubación, enjuague el sistema con un mililitro de 37 grados Celsius de medio de crecimiento celular completo para eliminar cualquier ARNm no consolidado.
Al final del análisis, vea los canales enumerados en el menú de canales y desplácese por los marcos de tiempo para inspeccionar las celdas preseleccionadas y sus señales fluorescentes integradas. Haga clic en una celda de interés para resaltar su curso de tiempo de fluorescencia, o haga clic en un curso de tiempo para encontrar la celda correspondiente. Pulse Mayús mientras hace clic en una celda para seleccionarla o des-seleccionarla.
Des-seleccione las células que no son viables o no están confinadas a un punto de adhesión o que están unidos a otra célula para excluirlos de análisis posteriores. Cuando todas las celdas se seleccionan o deseleccionan adecuadamente, guarde los cursos de tiempo de una sola celda para el área celular y la fluorescencia integrada en un directorio apropiado. Para cuantificar el tiempo de inicio de la traducción después de la transfección, y la fuerza de la expresión celular de EGFP, se puede emplear un modelo de traducción de tres etapas.
La solución modelo para EGFP se puede ajustar a cursos de tiempo unicelulares como se ilustra. Aquí, los histogramas del tiempo del inicio de la traducción y de la tarifa de la expresión de células transfected del lipoplex pueden ser observados. Como ambos parámetros se estiman para cada célula, la correlación de estos parámetros se puede analizar como se demuestra en el diagrama de dispersión, y en comparación con las células transfectadas con nanopartículas lipídicas.
Como se ha ilustrado, las células transfectadas con nanopartículas lipídicas exhiben menos variabilidad de célula a célula en comparación con las células transfectadas con lipoplexos. Y el promedio de la población demuestra un inicio más rápido de la traducción, así como una mayor tasa de expresión. Nuestro enfoque también se puede adaptar a métodos alternativos de micro-modelado.
Lo más importante para LISCA es un buen confinamiento celular y una combinación de análisis automatizado de imágenes con una supervisión conveniente del usuario. Como ha visto, el comportamiento celular es heterogéneo. Y las películas de lapso de tiempo unicelulares proporcionan acceso a dinámicas imparciales de las redes bioquímicas inherentes.
Por ejemplo, en la expresión verde, apoptosis o ensayos de matanza celular.
