Визуализация живых клеток одноклеточных массивов, называемых LISCA, также является автоматическим считыванием флуоресцентных временных курсов сотен отдельных клеток. Преимущество этого подхода заключается в том, что индивидуальные реакции клеток регистрируются из пространственно изолированных клеток в идентичных микросредах, что позволяет проводить эффективный анализ выбросов с большой статистикой. Чтобы изготовить одноэлементный массив, используйте скальпель, чтобы вырезать один шедевр PPM, содержащий шесть микропорошковых полос из слоя PDM, и поместите шедевр на лабораторный стенд с микроструктурой, обращенной вверх.
Используйте лезвие бритвы, чтобы разрезать каждую из шести микрошаблонных полос в штамп PDM, отрезав некоторые из узорчатых областей, чтобы убедиться, что края штампа открыты. Затем аккуратно поцарапайте защитную пленку крышки скольжения шестикамерной скользящей, чтобы отметить положения канала слайда и поместите крышку на скамейку защитной фольгой лицом вниз. Используйте пинцет, чтобы поместить штампы на крышку в отмеченных положениях канала, с микрошарами вниз, и проверьте прикрепление марок под микроскопом.
Квадраты, контактируемые со слайдом, будут выглядеть темнее, чем промежуточное пространство. Качество рисунка снижается квадратами, которые неправильно прикреплены к слайду. Если марки надежно прикреплены, обработайте крышку слипом и штампы кислородной плазмой при давлении 0,2 миллибара и приблизительно 40 Вт в течение трех минут, чтобы сделать поверхности между штампами PPM и крышкой скольжения гидрофильными.
В конце плазменной очистки поместите крышку в шкаф биобезопасности и добавьте 15 микролитров пегилированного раствора поли-l-лизина на каждый штамп, чтобы раствор впитывался в гидрофильный рисунок штампа. Через 20 минут промойте штампы одним миллилитром сверхчистой воды. Используйте пинцет, чтобы снять штампы с слайда и промыть крышку соскользнуть второй раз вторым миллилитром сверхчистой воды.
Когда крышка полностью высохнет, прикрепите шестиканальный липкий слайд к крышке, заботясь о том, чтобы микроструктурированные области выровнялись с нижней частью каналов. И добавьте 40 микролитров PBS и 40 микролитров раствора фибронектина в каждый канал. Чтобы смешать два раствора, удалите 40 микролитров из одного резервуара и трижды добавьте его в противоположный резервуар того же канала для получения однородного раствора.
Когда все каналы будут перемешаны, высиживайте слайд в течение 45 минут при комнатной температуре, прежде чем промывать каждый канал три раза со 120 микролитрами PBS на стирку. Поменяйте PBS до 37 градусов Цельсия, полностью дополните среду для роста клеток в каналах, добавив 120 микролитров среды в один резервуар и удалите ее из противоположного резервуара. Добавьте 40 микролитров из 400 000 клеток на миллилитр интересующих клеток и 40 микролитров клеточной питательной среды в каждый канал и смешайте клеточный раствор со средой, как показано.
После перемешивания удалите 40 микролитров суспензии из каждого канала так, чтобы только каналы были заполнены клеточной суспензией, и поместите слайд в инкубатор клеточной культуры. Через час проверьте адгезию клеток с помощью фазовой контрастной микроскопии и добавьте 120 микролитров среды роста клеток 37 градусов Цельсия в каждый канал, затем верните слайд в инкубатор клеточной культуры еще на три часа. Чтобы настроить перфузионную систему, подключите шприц в один миллилитр, заполненный средой роста клеток 37 градусов Цельсия, к впускной трубке системы и используйте клапан для заполнения трубки средой.
Подключите впускную трубку к резервуару одного канала, заботясь о том, чтобы пузырьки воздуха не задерживались, и подключите последовательный разъем к резервуару напротив впускной трубки текущего канала. Подключайте остальные каналы, как показано до тех пор, пока необходимое количество каналов не будет соединено последовательно. И подключите выпускную трубу непосредственно к свободному резервуару конечного канала.
Затем заполните подключенную трубку средой, чтобы убедиться, что перфузионный режим не протекает. Для покадровой визуализации клеток, для настройки протокола замедленной съемки для записи изображения фазового контраста и флуоресцентного изображения, установите оптическую конфигурацию для фазово-контрастной визуализации и флуоресцентной визуализации. Используйте 10-кратный объектив, соответствующие флуоресцентные фильтры и автоматизированную систему коррекции фокусировки, чтобы обеспечить лучшее качество изображения для долгосрочных измерений.
Выберите время экспозиции 10 миллисекунд для фазово-контрастной визуализации и 750-миллисекундное время экспозиции для записи интенсивности флуоресценции EGFP. Установите расписание с 10-минутным интервалом времени между последовательными циклами через список позиций и временем наблюдения 30 часов. Затем поместите шесть каналов слайда на один погреб подъем в держатель образца нагревательной камеры микроскопа 37 градусов Цельсия и приклейте трубку перфузионной системы к сцене.
Вставьте свободные концы выпускных трубок в коническую трубку объемом 15 миллилитров для сбора жидких отходов. И установите список позиций для измерения замедленной интервала сканирования, позаботясь о том, чтобы количество позиций можно было сканировать в течение определенного временного интервала между последовательными циклами через список позиций. Затем начните измерение интервала времени.
Для трансфекции клеток флуоресцентным маркером используйте шприц для промывки системы трубок одним миллилитром 37 градусов Цельсия PBS, заботясь о том, чтобы ступень микроскопа не двигался. После промывки заполните систему 300 микролитрами сывороточной восстановленной среды, дополненной интересующей мРНК, до конечной концентрации 0,5 нанограмма мРНК на микролитр и дайте липоплексам инкубироваться в течение одного часа. В конце инкубации промывайте систему одним миллилитром 37 градусов Цельсия полной средой роста клеток, чтобы удалить любую несвязанные мРНК.
В конце анализа просмотрите каналы, перечисленные в меню каналов, и прокрутите таймфреймы, чтобы проверить эти предварительно выбранные ячейки и их интегрированные флуоресцентные сигналы. Нажмите на интересуящея ячейку, чтобы выделить ее курс времени флуоресценции, или нажмите на курс времени, чтобы найти соответствующую ячейку. Нажмите клавишу SHIFT, щелкнув ячейку, чтобы выделить или отшельничить от нее.
Отсоедините любые клетки, которые нежизьки или не ограничены местом адгезии или которые прикреплены к другой клетке, чтобы исключить их из дальнейшего анализа. Когда все ячейки выбраны или отсеяны соответствующим образом, сохраните курсы времени для одной ячейки для области ячейки и встроенной флуоресценции в соответствующем каталоге. Для количественной оценки времени начала трансляции после трансфекции и силы клеточной экспрессии EGFP можно использовать трехступенчатую модель трансляции.
Модельное решение для EGFP может быть установлено на одноклеточных курсах времени, как показано на рисунке. Здесь могут наблюдаться гистограммы времени начала трансляции и скорости экспрессии липоплексных трансфефефицированных клеток. Поскольку оба параметра оцениваются для каждой клетки, корреляция этих параметров может быть проанализирована, как показано на диаграмме рассеяния, и сравнена с клетками, трансфектерифицированными липидными наночастицами.
Как показано на рисунке, клетки, трансфекированные липидными наночастицами, демонстрируют меньшую межклеточную изменчивость по сравнению с клетками, трансфекционными липоплексами. А средний показатель по населению демонстрирует более быстрое начало перевода, а также более высокую скорость выражения. Наш подход также может быть адаптирован к альтернативным методам микроструктурирования.
Наиболее важным для LISCA является хорошее заточение камер и сочетание автоматизированного анализа изображений с удобным наблюдением пользователя. Как вы видели, поведение клеток неоднородно. А одноклеточные покадровые фильмы обеспечивают доступ к непредвзятой динамике присущих биохимических сетей.
Например, в зеленой экспрессии, апоптозе или анализах уничтожения клеток.
