L’imagerie en cellules vivantes de réseaux unicellulaires appelée LISCA est également une lecture automatisée des cours de temps fluorescents de centaines de cellules individuelles. L’avantage de l’approche est que les réponses cellulaires individuelles sont enregistrées à partir de cellules spatialement isolées dans des micro-environnements identiques, ce qui permet une analyse efficace des émissions avec de grandes statistiques. Pour fabriquer un réseau unicellulaire, utilisez un scalpel pour couper un seul chef-d’œuvre de PDM contenant six micro-bandes de poudre de la couche de PDM, et placez le chef-d’œuvre sur le banc de laboratoire avec le motif micro vers le haut.
Utilisez une lame de rasoir pour couper chacune des six bandes micropattern dans un tampon PDMs, en coupant certaines des zones à motifs pour vous assurer que les bords du tampon sont ouverts. Ensuite, grattez soigneusement la feuille de protection du glissement de couverture d’une glissière à six chambres pour marquer les positions des canaux de la glissière et placez le glissement de couverture sur le banc avec la feuille de protection vers le bas. Utilisez une pince à épiler pour placer les timbres sur le bordereau de couverture aux positions de canal marquées, avec les micro-motifs vers le bas, et vérifiez la fixation des timbres au microscope.
Les carrés en contact avec la diapositive apparaîtront plus sombres que l’interespace. La qualité du motif est diminuée par les carrés qui ne sont pas correctement attachés à la diapositive. Si les timbres ont solidement fixé, traitez le glissement du couvercle et les timbres avec du plasma d’oxygène à 0,2 millibar de pression et environ 40 Watts pendant trois minutes pour rendre les surfaces entre les tampons PDP et le couvercle hydrophiles.
À la fin du nettoyage au plasma, placez le couvercle glisser dans une armoire de biosécurité et ajoutez 15 microlitres de solution de poly-l-lysine pégylée à chaque tampon afin que la solution soit absorbée dans le motif hydrophile du timbre. Après 20 minutes, rincez les timbres avec un millilitre d’eau ultrapure. Utilisez une pince à épiler pour retirer les timbres de la lame et rincez le glissement du couvercle une deuxième fois avec un deuxième millilitre d’eau ultrapure.
Lorsque le glissement du couvercle a complètement séché, fixez une glissière collante à six canaux au glissement du couvercle en prenant soin que les zones micro-modelées s’alignent sur le bas des canaux. Et ajoutez 40 microlitres de PBS et 40 microlitres de solution de fibronectine à chaque canal. Pour mélanger les deux solutions, retirez 40 microlitres d’un réservoir et ajoutez-le au réservoir opposé du même canal trois fois pour générer une solution homogène.
Lorsque tous les canaux ont été mélangés, incuber la lame pendant 45 minutes à température ambiante avant de laver chaque canal trois fois avec 120 microlitres de PBS par lavage. Échangez le PBS à 37 degrés Celsius, complétez entièrement le milieu de croissance cellulaire dans les canaux en ajoutant 120 microlitres de milieu à un réservoir et retirez-le du réservoir opposé. Ajouter 40 microlitres d’une suspension de 400 000 cellules par millilitre de cellules d’intérêt et 40 microlitres de milieu de croissance cellulaire à chaque canal, et mélanger la solution cellulaire avec le milieu comme démontré.
Après le mélange, retirez 40 microlitres de suspension de chaque canal afin que seuls les canaux soient remplis de suspension cellulaire, et placez la lame dans un incubateur de culture cellulaire. Après une heure, vérifiez l’adhérence cellulaire par microscopie à contraste de phase et ajoutez 120 microlitres de milieu de croissance cellulaire de 37 degrés Celsius à chaque canal, puis retournez la lame à l’incubateur de culture cellulaire pendant trois heures supplémentaires. Pour mettre en place un système de perfusion, connectez une seringue d’un millilitre remplie de milieu de croissance cellulaire de 37 degrés Celsius au tube d’entrée du système et utilisez la valve pour remplir le tube de milieu.
Connectez le tube d’entrée au réservoir d’un canal, en prenant soin qu’aucune bulle d’air ne soit piégée, et connectez un connecteur série au réservoir opposé au tube d’entrée du canal actuel. Connectez le reste des canaux comme illustré jusqu’à ce que le nombre requis de canaux soit connecté en série. Et connectez le tube de sortie directement au réservoir libre du canal final.
Remplissez ensuite le tube connecté avec un support pour confirmer que le système de perfusion ne fuit pas. Pour l’imagerie time-lapse des cellules, pour mettre en place un protocole time lapse pour l’enregistrement d’une image de contraste de phase et d’une image de fluorescence, définissez la configuration optique pour l’imagerie de contraste de phase et l’imagerie par fluorescence. Utilisez un objectif 10 fois, les filtres de fluorescence appropriés et un système automatisé de correction de la mise au point pour assurer une meilleure qualité d’image pour les mesures à long terme.
Sélectionnez un temps d’exposition de 10 millisecondes pour l’imagerie par contraste de phase et un temps d’exposition de 750 millisecondes pour enregistrer l’intensité de fluorescence EGFP. Définissez une planification temporelle avec un intervalle de temps de 10 minutes entre les boucles consécutives dans la liste des positions et un temps d’observation de 30 heures. Ensuite, placez la lame à six canaux sur la seule cave dans le porte-échantillon de la chambre de chauffage à 37 degrés Celsius du microscope et collez le tube du système de perfusion jusqu’à la scène.
Insérez les extrémités libres des tubes de sortie dans un tube conique de 15 millilitres pour recueillir les déchets liquides. Et définissez la liste des positions pour la mesure du time lapse de numérisation, en prenant soin que le nombre de positions pourra être analysé dans l’intervalle de temps défini entre les boucles consécutives à travers la liste des positions. Ensuite, démarrez la mesure du laps de temps.
Pour la transfection des cellules avec un marqueur fluorescent, utilisez une seringue pour rincer le système de tubes avec un millilitre de 37 degrés Celsius PBS, en prenant soin que l’étape du microscope ne bouge pas. Après rinçage, remplissez le système de 300 microlitres de milieu sérique réduit complété par l’ARNm d’intérêt, à une concentration finale de 0,5 nanogramme d’ARNm par microlitre, et laissez les lipoplexes incuber pendant une heure. À la fin de l’incubation, rincer le système avec un millilitre de milieu de croissance cellulaire complet de 37 degrés Celsius pour éliminer tout ARNm non lié.
À la fin de l’analyse, affichez les canaux répertoriés dans le menu des canaux et faites défiler les délais pour inspecter les cellules présélectionnées et leurs signaux fluorescents intégrés. Cliquez sur une cellule d’intérêt pour mettre en évidence son cours de temps de fluorescence, ou cliquez sur un cours de temps pour trouver la cellule correspondante. Appuyez sur Maj tout en cliquant sur une cellule pour la sélectionner ou la désélectélirer.
Désélectrez toutes les cellules qui ne sont pas viables ou qui ne sont pas confinées à un point d’adhérence ou qui sont attachées à une autre cellule pour les exclure d’une analyse plus approfondie. Lorsque toutes les cellules sont sélectionnées ou désélectionnées de manière appropriée, enregistrez les cours de temps d’une seule cellule pour la zone cellulaire et la fluorescence intégrée dans un répertoire approprié. Pour quantifier le temps de début de traduction après la transfection, et la force de l’expression cellulaire d’EGFP, un modèle de traduction en trois étapes peut être employé.
La solution modèle pour EGFP peut être adaptée aux cours de temps à cellule unique, comme illustré. Ici, on peut observer des histogrammes du temps de début de traduction et du taux d’expression des cellules transfectées lipoplex. Comme les deux paramètres sont estimés pour chaque cellule, la corrélation de ces paramètres peut être analysée comme démontré dans le nuage de points, et comparée aux cellules transfectées avec des nanoparticules lipidiques.
Comme illustré, les cellules transfectées avec des nanoparticules lipidiques présentent moins de variabilité de cellule à cellule que les cellules transfectées avec des lipoplexes. Et la moyenne de la population démontre un début plus rapide de la traduction, ainsi qu’un taux d’expression plus élevé. Notre approche peut également être adaptée à d’autres méthodes de micro-modelage.
Le plus important pour LISCA est un bon confinement cellulaire et une combinaison d’analyse d’image automatisée avec une supervision pratique de l’utilisateur. Comme vous l’avez vu, le comportement des cellules est hétérogène. Et les films time lapse unicellulaires donnent accès à une dynamique impartiale des réseaux biochimiques inhérents.
Par exemple, dans l’expression verte, l’apoptose ou les tests de destruction cellulaire.
