Nuestro protocolo para células de levadura de alto rendimiento permite el seguimiento del crecimiento y la expresión génica de miles de microcolonías simultáneamente. Se puede cuantificar la diferencia entre cepas, entre entornos e incluso entre células genéticamente idénticas cultivadas en un entorno compartido. El protocolo produce estimaciones precisas de la tasa de crecimiento promedio y la intensidad media de fluorescencia de los reporteros de expresión génica.
Además, debido a que se dicen tantas microcolonías individuales, se obtienen estimaciones precisas de distribuciones enteras de valores de crecimiento y expresión. Este protocolo sigue dos pasos principales, la preparación de la placa experimental y la preparación de las células para la toma de imágenes. Las células deben estar chapadas inmediatamente después de la dilución y la mezcla.
Así que recomendamos configurar su placa experimental primero. Notarás la mezcla repetida de células a lo largo de este protocolo, que es extremadamente importante en los pasos hasta el chapado. El día del experimento, todos los medios y otras soluciones utilizadas para el ensayo deben filtrarse con un filtro de dos micras, incluso si ya son estériles, con el fin de eliminar cualquier cristal que pueda aparecer en imágenes de microscopio.
Esto incluye los medios experimentales y la solución Concanavalin A. A continuación, prepare la placa del microscopio. Con el fin de mantener la superficie de vidrio de los pozos libre de escombros y arañazos, mantenga siempre una pelusa y una toallita libre estática debajo de la placa.
Utilice una técnica estéril en un banco esterilizado. Filtrar 25 mililitros de solución 1X Concanavalina A y pipeta 200 microlitros en cada pozo de la placa del microscopio. Recomendamos estabilizar la pipeta para garantizar la altura adecuada.
Centrífuga la placa del microscopio con una pelusa y una toallita libre estática debajo de ella durante dos minutos a 411 veces G con el fin de eliminar cualquier burbuja de aire que podría evitar que concanavalina A cubra uniformemente la parte inferior de los pozos. Deje reposar la placa que contiene la solución Concanavalin A durante una o dos horas. Sé consistente en tus experimentos.
Después de la incubación concanavalina A, despeje la Concanavalina A de la placa de pozo 96 ya sea con un dispositivo de succión o tirando con fuerza la solución fuera de la placa como se muestra aquí. Algunas gotas permanecerán. A continuación, lave los pozos añadiendo 400 microlitros de agua estéril a cada pozo.
Añadir el agua inmediatamente después de eliminar la solución concanavalina A. No deje que el plato se seque. Es importante evitar tocar la parte inferior recubierta de la placa con las puntas de la pipeta con el fin de no desplazar o eliminar la concanavalina A de la superficie de vidrio de los pozos.
Retire el agua de la misma manera que la solución Concanavalin A y agregue inmediatamente 185 microlitros de medios experimentales a su placa de microscopio. No permita que el plato se seque. La placa ya está lista para la adición de 50 microlitros de células diluidas.
Recupera tu placa aleatoria de 96 pozos pre-cultivada. La pregunta experimental determinará si las celdas están saturadas o en fase de registro y el número de réplicas aleatorias que se deben usar en el ensayo. Centrífuga su placa durante dos minutos a 411 veces G para minimizar la posibilidad de contaminación cruzada al quitar la cubierta de la lámina.
Asegúrese de nunca inclinar la placa cuando la esté manejando. Si la levadura y los medios entran en contacto con la lámina que cubre la placa, puede haber contaminación en los pozos. Primero prepare las placas en las que llevará a cabo sus diluciones en serie.
Añade 90 microlitros de medios experimentales a cada una de tus placas de dilución. Luego prepara tus células. Tenga mucho cuidado al quitar la lámina de su placa de 96 pozos para evitar que las gotas de un pozo entren en otro.
La levadura se concentrará en la parte inferior de la placa debido a la centrifugación. Para asegurarse de que las células estén bien mezcladas durante la dilución, agregue siempre un pequeño volumen de células a un mayor volumen de medios. A continuación, agregue otro gran volumen de medios a la mezcla.
Asegúrese de mezclar la pipeta vigorosamente en cada paso. En este video, realizamos diluciones para células de levadura a saturación y medios completos sintéticos, que diluiremos 10.000 veces para lograr una concentración final de unas 4.000 células por pozo en la placa del microscopio. Para volver a suspender las celdas, pipetear hacia arriba y hacia abajo vigorosamente y mover la punta de la pipeta alrededor del pozo en un movimiento circular.
Después de la mezcla, no debe haber rastros de levadura asentada que permanezca en cualquier pozo, así como visto aquí en el pozo A1. Todos los demás pozos mostrados aquí no han sido re-suspendidos para la comparación. Cuente las células de su placa pre-cultivada, por ejemplo, con el hemociclo, y combínalas con cualquier otra cepa que añadas al mismo pozo en proporciones iguales. Aquí, mezclamos las células de nuestra placa pre-cultivada con una cepa de referencia fluorescente en una proporción de uno a uno.
Una vez estandarizadas las concentraciones celulares, agregue diez microlitros de células a la primera placa de dilución en serie. A continuación, añadir 100 microlitros de medios a un volumen final de 200 microlitros. Con la adición de células y medios por igual, la pipeta se mezcla vigorosamente, moviendo la punta de la pipeta alrededor de los pozos en un movimiento circular.
A partir de este momento, hasta que las células se agreguen a la placa del microscopio, proceda rápidamente a través del protocolo. A continuación, agregue diez microlitros de levadura de la primera placa de dilución serie a la segunda placa de dilución en serie. A continuación, añadir 100 microlitros de medios experimentales a eso.
Mezcle bien. Si la levadura no tiene una tendencia a flocular, entonces están listos para ser añadidos a la placa del microscopio directamente después de este paso. Proceda inmediatamente al chapado.
Sin embargo, si las cepas de levadura que está utilizando tienen una tendencia moderada a floccular, será necesario el siguiente paso de sonicación opcional. Si sonicas, la primera pipeta mezcla la solución de levadura una vez más, antes de la sonicación. Coloque la levadura diluida en el sonicator y sumerja los pasadores de 96 pozos en la solución de cada pozo, pero no tocando la parte inferior del pozo.
Establezca el programa de sonicación, que es lo suficientemente fuerte como para separar las células de levadura floculadas, pero no mata las células ni causa respuestas de estrés elevadas. Es posible que se requieran algunas pruebas para identificar el mejor programa de sonicación para un experimento determinado. Una vez completado el programa, retire las celdas y proceda inmediatamente al siguiente paso.
Agregue 15 microlitros de levadura de la segunda placa de dilución serie a la placa del microscopio. Pipeta arriba y abajo para mezclar, pero hacerlo cuidadosamente para evitar perturbar la Concanavalina A unida a la parte inferior de los pozos de la placa. A continuación, añadir 200 microlitros de medios experimentales a un volumen final de 400 microlitros, a la placa del microscopio.
Pipeta mezclar con cautela. Cubra la placa con una membrana transpirable. Asegúrese de que los bordes de la placa estén bien sellados.
Centrífuga la placa del microscopio con una pelusa y tejido libre estático debajo de ella durante dos minutos a 411 veces G con el fin de que las células de levadura se unan a la Concanavalina A en la parte inferior de la placa. La placa ya está lista para ser imagen. En el microscopio, limpie la parte superior e inferior de la placa con una pelusa y una toallita libre estática y sople aire comprimido en la parte inferior de la placa para eliminar los desechos.
Coloque la placa en el microscopio. Asegúrese de que el pozo A1 está en la esquina superior izquierda y de que el microscopio se calienta a la temperatura correcta para el crecimiento celular. Asegúrese también de que la placa esté perfectamente metida en el microscopio y de que la parte inferior de la placa esté plana.
Si la placa tiene una cubierta de plástico, retírela antes de iniciar la microscopía. Esto será importante para capturar buenas imágenes para el análisis posterior. Cargamos un archivo generado automáticamente con las coordenadas X e Y y las posiciones focales para crear imágenes de toda la placa del microscopio.
Si utiliza un archivo generado previamente, compruebe algunas posiciones en la placa del microscopio para asegurarse de que las celdas estén en el plano focal correcto. Es útil que el plano focal esté ligeramente por encima de las celdas para que estén rodeadas por un borde oscuro y sean más brillantes que el fondo. Establezca el número de puntos de tiempo y el espaciado de punto de tiempo que usará para el experimento.
Si está recopilando datos de velocidad de crecimiento e intensidad de fluorescencia, configure también un programa de imágenes de fluorescencia. Ajuste el brillo en cada canal que se va a tomar para que no se exponga en exceso ninguna posición en la placa del microscopio. Pruebe la exposición que utilizará cuando no esté en modo en vivo.
Para las imágenes fluorescentes, la fluorescencia debe ser visible a simple vista. Pero de lo contrario recomendamos establecer valores de exposición bajos. Las colonias adecuadamente espaciadas sembradas por células individuales crecen en una monocapa a lo largo de la superficie de la placa.
Como resultado, el análisis automatizado de imágenes se puede utilizar para calcular con precisión la tasa de crecimiento de muchas microcolonías individuales. Los marcadores fluorescentes se pueden utilizar para diferenciar múltiples cepas que crecen en el mismo pozo. Como resultado, se pueden calcular distribuciones enteras de las tasas de crecimiento de las microcolonías individuales que crecen en un entorno compartido.
Los grandes tamaños de muestra alcanzables con este experimento también permiten una estimación precisa de las diferencias medias entre diferentes cepas o condiciones de crecimiento. Aquí se muestran las tasas de crecimiento de los conjuntos emparejados de colonias cultivadas en pozos individuales a partir de un conjunto de líneas de acumulación de mutaciones y las colonias de control de referencia de GFP en pozo. Si se observan células aglomeradas en la placa del microscopio, los grumos deben dividirse por sonicación antes de chapar.
Las células en grupos que no se descomponen no crecerán en una microcolonía plana a lo largo de la superficie de la placa, haciendo imposible el cálculo correcto de la tasa de crecimiento. No todos los medios son compatibles con el ensayo de la tasa de crecimiento de microcolonía. Algunas formas de medios, incluyendo medios que contienen extracto de levadura o tiene un pH bajo, evitan la unión de células a Concanavalin A.Esto resulta en células flotando lejos de microcolonias en crecimiento en el transcurso del experimento y una medición errónea de la tasa de crecimiento.
Es importante evitar las células de chapado demasiado densamente. Cuando las células están demasiado cerca, las microcolonias de crecimiento más rápido se fusionan en puntos de tiempo anteriores, que se muestran aquí como una pérdida de seguimiento de color. Este efecto puede sesgar las estimaciones de la tasa de crecimiento, ya que las colonias de crecimiento lento son menos propensas a fusionarse con sus vecinos antes de que se recopilen datos de suficientes puntos de tiempo.
Dependiendo de las condiciones de crecimiento, un subconjunto de células puede someterse a una fase de retraso antes de comenzar a crecer. Es importante tener en cuenta esto cuando se utilizan áreas de colonia para calcular la tasa de crecimiento en lugar de ajustar una curva de crecimiento a todos los puntos de tiempo disponibles. El protocolo descrito se puede utilizar para investigar una amplia gama de cuestiones relacionadas con el crecimiento y la evolución de la levadura.
Su formato flexible de microplaca significa que se puede adaptar a otras especies de levaduras, diferentes condiciones de crecimiento, otros microbios, y potencialmente otras células en el cultivo.
