Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust, GlaxoSmithKline (GSK) y el Instituto Escocés de Señalización Celular (ahora parte de la fosforilación de la proteína MRC y la unidad Ubiquitylation).

1. Fase de Desarrollo de Ensayos Nota: antes de iniciar la pantalla de siRNA, una etapa de desarrollo de ensayos es fundamental establecer parámetros importantes para el cribado con el reportero línea celular. Es esencial invertir esfuerzo importante en esta etapa, ya que será la base del futuro éxito de la pantalla. <ol><li> Para caracterizar la hipoxia-capacidad de respuesta de U20S-HRE reportero línea celular, creciendo 2 x 75 cm 2 frascos de células U20S-HRE a 80-90% de confluencia en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de FBS. </li><li> Aspirar los medios de comunicación de un matraz de células, se lava dos veces con 10 ml de PBS y separar las células mediante la adición de 2 ml de solución de tripsina-EDTA 0,05% e incubando a 37 ° C durante 5 min. Resuspender las células en 8 ml de DMEM 10% de SFB y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para crear una suspensión celular homogénea. </li><li> Pipetear 20 l de la suspensión a una cámara de recuento de células, por duplicado, e inserte la cámara en un cou células automatizadonter. Haga clic en &quot;Mostrar Imagen&quot; en el software del contador de células y asegurar que las células están en foco. Haga clic en &quot;Cuenta&quot; y tome nota de la densidad celular. Repita esto para el otro duplicado y calcular la densidad celular promedio. Diluir las células con DMEM 10% de FBS a una concentración de 60.000 células / ml. </li><li> Con una pipeta multicanal, añadir 100 ml (6.000 células) de las células diluidas a los mismos tres columnas (por ejemplo A5-H5, H6-A6 y A7-H7) de 5 placas de 96 pocillos de ensayo de paredes blancas estériles, y la transferencia a un humidificado 37 ° C incubadora a 5% de CO 2 durante la noche. Nota: estas placas se utilizarán para determinar la salida de la luciferasa hipoxia que dependen de una serie de exposiciones de hipoxia: 0 h, 2 h, 6 h, 10 hy 24 h. </li><li> Al final del día siguiente, anote la hora y agregue la placa de la hipoxia de 24 horas a la estación de trabajo conjunto hipoxia al 1% de oxígeno. A la mañana siguiente, calcule el tiempo de 10 horas, 6 horas y 2 horas antes de que la placa de 24 horas se debe a ser eliminado frOM la estación de trabajo hipoxia. En estos momentos, añadir el 10 horas, 6 horas y 2 placas hr a la estación de trabajo de la hipoxia. </li><li> Preparar 30 ml de 2x tampón de lisis de luciferasa / ensayo combinado (50 mM de Tris fosfato de pH 7,8; 16 mM de MgCl 2; DTT 2 mM; 2% de Triton-X-100; 30% de glicerol; mM de ATP 1; 1% de BSA; 0,25 mM luciferina y 8 mM Na 4 P 2 O 7). Nota: agregar los componentes en el orden de la lista y permitir que la BSA al menos 30 minutos para disolver antes de la adición de luciferina y Na 4 P 2 O 7. </li><li> Eliminar todas las placas de la estación de trabajo de la hipoxia en el momento apropiado. Añadir 100 l de 2x tampón de lisis de luciferasa / ensayo a los pocillos apropiados de la placa de ensayo y cubrir con film transparente. Agitar las placas en un agitador de placas durante 10 min a 500 rpm para lisar completamente las células. </li><li> Transfiera la pila de placas de 96 pocillos a una placa de bastidor automatizado luminómetro. Bajo el menú &quot;Protocolos&quot;, seleccione &quot;abs 595&quot; y poner de relieve todo wells para ser leídos en el mapa de placa en la pantalla del menú &quot;bien la selección&quot;. Haga clic en &quot;Ejecutar&quot; para medir la luminiscencia de cada pocillo y luego calcular el promedio de lectura de cada placa. Calcular la hipoxia que dependen plegable aumento de la actividad del indicador dividiendo el promedio de lectura de cada placa hipoxia por la lectura promedio de la normoxia (0 hr hipoxia) Placa de control. Nota: es esencial observar una robusta respuesta de luciferasa dependiente de hipoxia de ser adecuado para el cribado. A veces más metro setenta y cinco, en la actividad del indicador se considera excelente. </li><li> Crear una placa de control maestro que contiene cuatro (HIF1A siRNA) réplicas (pozos A1-D1), cuatro bajo control (FIH1 siRNA) replica (pozos A12-D12) de alto control, cuatro almacenamientos intermedios sólo controlar repeticiones (pozos E1-H1) y cuatro réplicas de control de siRNA no objetivo (E12-H12), donde todos los grupos de siRNA se encuentran a una concentración de 200 nM. Nota: Los controles de alta y baja se establecen sobre la base de los reguladores de la vía conocidos que aumentan y decrfacilitar la respuesta a la hipoxia, respectivamente. Alternativamente, el desarrollo del ensayo usando un subconjunto de la biblioteca se puede utilizar para identificar los controles adecuados. </li><li> Con una pipeta multicanal, transferir 10 l de cada siRNA control a un blanco placa de ensayo amurallada estéril. Prepare la mezcla de transfección de reactivos de transfección de 0,1 l en 10 l medio reducido de suero (1:100) por pocillo, y la transferencia de 10 l de mezcla de transfección para cada pocillo de control. Pipetear hacia arriba y hacia abajo brevemente para mezclar, y dejar la placa en reposo durante 20 a 60 minutos para permitir la formación de complejos de transfección. </li><li> Preparar una suspensión de células de 75.000 células / ml con el segundo recipiente con células U20S-HRE. Usando una pipeta multicanal, añadir 80 l (6.000 células) de la suspensión celular a cada mezcla de transfección. Colocar la placa en un humidificado incubadora a 37 º C con CO2 al 5% durante 24 horas, luego se transfieren a una estación de trabajo hipoxia durante 24 horas más y realizar ensayos de luciferasa como se describe en los pasos 1.6-1.8. </li><li> Calcular el factor Z para los controles alto y bajo utilizando la fórmula Z = 1 - [3 x (desviación estándar de alta Control + desviación estándar de bajo el control) / (media de control de alta - media de baja de control)]. Nota: un valor de entre 0,5 a 1 indica un excelente ensayo y debe ser esforzó para. </li></ol> 2. Pantalla Principal Nota: una vez que estas condiciones básicas de la etapa de desarrollo del ensayo están en su lugar, la pantalla principal se puede realizar por triplicado en formato de 96 pocillos de la placa usando el siguiente protocolo. <ol><li> Grow 7 x 75 cm 2 frascos de células U20S-HRE a 80-90% de confluencia en DMEM suplementado con 10% v / v de suero bovino fetal (FCS). Nota: Los siguientes pasos 2.2 a 2.13 deben llevarse a cabo en el Día 1. </li><li> Iniciar réplica 1 preparando una placa de control maestro que contiene 200 l de cada control como se describe en el paso 1.9 y descongelación a cabo una serie de diluciones del ubiquitome l siRNAibrary por un mínimo de 30 min. Nota: Cada pocillo contiene una piscina de 4 siRNAs reunidos en 17 placas de 96 pocillos que con las columnas 1 y 12 se deja vacío para los controles. </li><li> En una campana de flujo laminar, la etiqueta (o de código de barras) 17 de paredes blancas placas de ensayo estériles con tapas de los números 1-17, correspondiente a cada placa de la serie de siARN. </li><li> Centrifugar la placa de control maestro y el ARNsi ubiquitome brevemente biblioteca (1 min a 2.000 xg) para asegurar que todos los siRNAs se acumulan en la parte inferior del pozo. </li><li> Utilice un dispensador de líquido automatizado para &quot;estampar&quot; robóticamente 10 l de cada control de la placa de control principal en las 17 placas de ensayo, usando la misma pila de punta de 96 pocillos para cada plato. </li><li> El uso de una pila fresca de 96 pocillos punta para cada una de las 17 placas de biblioteca, la transferencia de 10 l de cada ubiquitome ARNsi a su placa de ensayo correspondiente usando un dispensador de líquido automatizado. </li><li> Preparar 40 ml de reactivo de transfección para las 17 placas de ensayo utilizando los ES relacióntablished en 1.10. Nota: esto incluye un adicional de 20 ml para tener en cuenta el &quot;volumen muerto&quot; en el dispensador de la célula. El &quot;volumen muerto&quot; se refiere al volumen de líquido continuamente presente dentro de la red de tubos en el dispensador de células. </li><li> Utilice un dispensador de células automatizado para transferir 10 l de reactivo de transfección para cada pocillo en las placas de ensayo 17. Brevemente agitar las placas de ensayo en un agitador (1 min a 500 rpm) para permitir la mezcla completa de siRNA y reactivo de transfección, a continuación, dejar todavía a temperatura ambiente durante 20-60 minutos para permitir la ARNsi: la formación de complejos reactivo de transfección. </li><li> Lavar dos matraces de 75 cm2 de células U20S-HRE dos veces con 10 ml de PBS y separar con 2 ml de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 5 min. Añadir 8 ml de DMEM 10% de FBS a cada matraz y la pipeta arriba y abajo varias veces para crear una suspensión celular homogénea. Combinar las células de ambos matraces y transferir a un tubo de plástico de 50 ml estéril. </li><li> Calcular la concentración de células pipeteando20 células mu l por duplicado a una cámara de recuento de células y calcular la concentración celular media de dos lecturas de un contador automático de células como se describe en el paso 1.3. </li><li> Preparar 155 ml de suspensión de células por dilución con DMEM 10% de FBS a una concentración de 75.000 células por ml en un recipiente de plástico estéril. Nota: este volumen es suficiente para 17 placas y se incluye un adicional de 25 ml para el volumen muerto en el dispensador de células. </li><li> Añadir un agitador magnético estéril a la suspensión celular y el lugar en un agitador instalado en el interior de la campana de flujo laminar para limitar la formación de grumos de células. Equilibrar el dispensador automático de células con la suspensión celular y configurarlo para dispensar 80 l de células por pocillo (6.000 células). </li><li> Coloque cada una de las 17 placas, a su vez, en el dispensador automático de células y dispensar células. Registre el tiempo y las placas de la pila en grupos de 5 a continuación, coloque las pilas en un húmedo 37 ° C incubadora a 5% de CO 2 durante 24 horas. Nota: la concentración final depiscina siRNA será 20 nM en 100 l de volumen total. Nota: Los siguientes pasos 02.14 a 02.15 deben llevarse a cabo en el Día 2. </li><li> Inicie la segunda réplica en el día 2, siguiendo el procedimiento indicado en el Día 1 para la replicación 1 (02.02 a 02.13). </li><li> Después de 24 horas de la transfección, las placas de transferencia de réplica 1 en un ambiente estéril a una estación de trabajo hipoxia fijaron en 1% de oxígeno y dejan durante 24 horas para inducir el reportero EDH. Nota: Los siguientes pasos 02.16 a 02.20 deben llevarse a cabo en el Día 3. </li><li> Inicie la tercera réplica, siguiendo el procedimiento indicado en el Día 1 para la replicación 1 (2.2 a 2.13). </li><li> Después de 24 horas de la transfección, las placas de transferencia de réplica 2 en un ambiente estéril a una estación de trabajo hipoxia fijaron en 1% de oxígeno y dejan durante 24 horas para inducir el reportero EDH. </li><li> Dos horas antes de replicar 1 placas son para ser retirado de la estación de trabajo de la hipoxia, se preparan 200 ml de tampón de lisis 2x luciferasa / ensayo como se describe en 1.6. Nota: este volumen encluye un adicional de 20 ml para asegurar el depósito de regulación se mantiene bien cubierto. </li><li> Retire replicar 1 placas de ensayo de la estación de trabajo de la hipoxia después de la exposición hipoxia 24 horas y el uso de un dispensador de líquido automatizado, añadir 100 l de tampón de lisis 2x luciferasa / ensayo a cada placa de ensayo y cubrir con film transparente. </li><li> Agitar las placas en un agitador de células durante 10 min a 500 rpm para lisar completamente las células. Transfiera cada placa a su vez a un lector de placas luminómetro y luminiscencia registro tal como se describe en el paso 1.8. Nota: Los siguientes pasos 02.21 a 02.22 deben llevarse a cabo en el Día 4. </li><li> Después de 24 horas de la transfección, las placas de transferencia de réplica 3 en un ambiente estéril a una estación de trabajo hipoxia fijaron en 1% de oxígeno y dejan durante 24 horas para inducir el reportero EDH. </li><li> Lea la réplica 2 placas siguiendo los pasos utilizados para la replicación 02.18 a 02.20 1. Nota: el siguiente paso 2.23 debe llevarse a cabo en el Día 5. </li><li> Lea las réplicas de 3 platos siguiendo02.18-02.20 paso utilizado para la réplica 1. </li><li> Compilar los 3 repeticiones de la pantalla principal, y calcular el factor Z de cada placa utilizando la fórmula dada en 1.12. Nota: si cualquier placa tiene un factor Z de menos de 0,5, considerar la repetición de esta placa para mejorar la calidad de los datos. </li><li> Calcular el coeficiente de varianza (CV) para el alta y los controles bajos mediante el uso de la siguiente fórmula: 100 x desviación estándar del control / promedio de control. Nota: CV debe ser lo más bajo posible, es razonable esperar que la variación del 10-15%. Si la variación es significativamente mayor, considere la repetición de la placa. </li><li> Calcular ciento activación de cada siRNA por placa utilizando la siguiente fórmula: [(media de alto control - score siRNA) / (media de alto control - media de baja control)] x 100 Además, el cálculo de las especies no objetivo (NT. ) veces de cada siRNA utilizando la fórmula [Sample data / media de NT]. Por tanto la activación por ciento y NT veces, calcular la media de los tres replicaates y compilar los valores. </li><li> Utilizando los datos en bruto, el cálculo de Posición Coeficiente de correlación de Spearman (SRCC) para determinar cómo de cerca las tres placas replicadas se correlacionan con la fórmula: <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51572/51572eq1.jpg" width="120" /> donde r = SRCC; d = diferencia entre los dos números en cada par de filas y n = número de pares de datos. Nota: una buena correlación entre las réplicas de la placa dará valores cercanos a 1 Si una réplica muestra bajo SRCC contra los otros 2 platos, investigar más a fondo y considerar la repetición de ese plato.. </li><li> Decida qué siRNAs son de suficiente interés para la investigación secundaria (hasta el 80). Emplear puntos de corte definidos por el usuario (por ejemplo, la selección de todos los siRNAs que muestran menos del 5% o más del 95% de activación por ciento, o menos de 0,5 NT veces o más de 1,5 veces el NT) o aplicar la bioinformática o razonamiento basado en el conocimiento para buscar grupos de golpea comprendidos en la misma vía de UBL. Nota:normalmente, una combinación de estos enfoques determina que se toman siRNA en el cribado secundaria. </li></ol> 3. Pantalla secundaria Nota: una pantalla secundaria de confirmación se lleva a cabo sobre la base de un máximo de 80 siRNAs de interés desde la pantalla principal. Este número se puede llevar a cabo convenientemente con cada réplica chapada en una sola placa de 96 pocillos con controles completos como por la pantalla principal (ver 2.2). Es muy útil para confirmar que los reguladores identificados en la pantalla principal de manera reproducible provocan el mismo fenotipo, y esto le ayudará a perfeccionar las decisiones de triage en el que golpea debe realizarse a través de la pantalla final terciaria / deconvolución. <ol><li> Grow 1 x 75 cm 2 frasco de células U20S-HRE a 80-90% de confluencia en DMEM con 10% de SFB. </li><li> Anote el número de la placa y la ubicación de los éxitos de la pantalla principal, y planificar su nueva ubicación en la cereza pantalla secundaria recogió la placa principal, dejando las columnas 1, unad 12 libre para los controles. Preparar la placa de control maestro como en 1.9 pero con un volumen total de cada control de 50 l. </li><li> Descongele una segunda serie de dilución de la biblioteca ubiquitome (reservado para piscinas siRNA individuales cherry-picking) por un mínimo de 30 min. Centrifugar brevemente placas (1 min a 2.000 xg) a continuación, añadir 50 l de los siRNAs pantalla secundaria a sus nuevas ubicaciones de la placa en la cereza recogido placa maestra. </li><li> Llevar a cabo la pantalla secundaria utilizando el mismo protocolo básico descrito para la pantalla primaria con las siguientes modificaciones: (a) ejecutar todas las tres repeticiones en el mismo día en una placa de ensayo por repetición y (b) ajustar los volúmenes de reactivos en consecuencia. </li></ol> 4. Terciario Deconvolution Screen / Nota: el cribado terciario o deconvolución se realiza en un máximo de 20 siRNAs de la pantalla secundaria. Este paso es examinar el efecto de la caída en el uso de cada siRNA individuo del poo originalesl de cuatro. Normalmente, al menos, dos dúplex siRNA individuales de cada grupo deben ilícito el mismo fenotipo que tener un grado razonable de confianza de que el fenotipo observado no se debe a siRNA fuera de objetivo efectos. Para aumentar aún más la confianza en esta etapa, dúplex siRNA dirigidos individuales adicionales del gen en cuestión pueden ser diseñados y probados por su capacidad de provocar el fenotipo dado. Los resultados de estos experimentos pueden usarse entonces para calcular la puntuación H, donde H = 0,6 o más (es decir, donde al menos 3 de 5 siRNAs individuales obtener la fenotipo) se considera aceptable 6. <ol><li> Crecer un 75 cm 2 frasco de células U20S-HRE a 80-90% de confluencia en DMEM con 10% de SFB. </li><li> Crear un mapa de la placa de la pantalla superior mediante la planificación de la ubicación de los cuatro dúplex siRNA individuales de cada golpe en la placa principal de pantalla superior, dejando las columnas 1 y 12 libre para los controles. Preparar la placa principal de control como en la 1.9 pero con un totalvolumen de cada control de 50 l. </li><li> Descongelar las placas deconvolución / siRNA individual y añadir 50 l de los siRNAs individuales (200 nM) en cada pocillo de la placa maestra pantalla terciario según el mapa de la placa (4.2) para permitir tres x 10 repeticiones ly un cómodo 20 l exceso . </li><li> Realizar la pantalla superior utilizando el mismo protocolo básico esbozado para la pantalla principal con las siguientes modificaciones: (a) ejecute las tres repeticiones en el mismo día en una placa de ensayo por repetición y (b) ajustar los volúmenes de reactivos en consecuencia </li></ol> Nota: Lo ideal sería que el umbral para ARNsi dúplex individuales debe fijarse en la misma rigurosidad de corte como para la piscina. Sin embargo, puede ser aceptable para relajar el umbral en un 10-20% de siRNAs individuales, especialmente donde al menos otro dúplex cae dentro del umbral establecido. Es cojinete vale la pena en cuenta que el efecto individual de siRNAs puede ser menor que la dela piscina, y por el contrario, en algunos casos siRNAs individuales pueden mostrar un mayor efecto sobre el fenotipo celular en aislamiento que cuando existe en la piscina (incluso cuando la concentración se explica).

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	<li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins.">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458, 422-429 (2009).</li><li>Schulman, B. A., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+activation+by+E1+enzymes:+the+apex+for+downstream+signalling+pathways.">Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes: the apex for downstream signalling pathways.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 319-331 (2009).</li><li>Siomi, H., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+road+to+reading+the+RNA-interference+code.">On the road to reading the RNA-interference code.</a> Nature. 457, 396-404 (2009).</li><li>Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensing+by+metazoans:+the+central+role+of+the+HIF+hydroxylase+pathway.">Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway.</a> Mol Cell. 30, 393-402 (2008).</li><li>Melvin, A., Mudie, S., Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+remodeler+ISWI+regulates+the+cellular+response+to+hypoxia:+role+of+FIH.">The chromatin remodeler ISWI regulates the cellular response to hypoxia: role of FIH.</a> Mol Biol Cell. 22, 4171-4181 (2011).</li><li>Bhinder, B., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+analyzing+actives+in+random+RNAi+screens:+introducing+the+&amp;#34;H+Score&amp;#34;+for+hit+nomination+&amp;+gene+prioritization.">A simple method for analyzing actives in random RNAi screens: introducing the &amp;#34;H Score&amp;#34; for hit nomination &amp; gene prioritization.</a> Comb Chem High Throughput Screen. 15, 686-704 (2012).</li><li>Bett, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P-body+component+USP52/PAN2+is+a+novel+regulator+of+HIF1A+mRNA+stability.">The P-body component USP52/PAN2 is a novel regulator of HIF1A mRNA stability.</a> Biochem J. 451, 185-194 (2013).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Birmingham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+methods+for+analysis+of+high-throughput+RNA+interference+screens.">Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens.</a> Nat Methods. 6, 569-575 (2009).</li><li>Stagg, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TRC8+E3+ligase+ubiquitinates+MHC+class+I+molecules+before+dislocation+from+the+ER.">The TRC8 E3 ligase ubiquitinates MHC class I molecules before dislocation from the ER.</a> J Cell Biol. 186, 685-692 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF146+is+a+poly(ADP-ribose)-directed+E3+ligase+that+regulates+axin+degradation+and+Wnt+signalling.">RNF146 is a poly(ADP-ribose)-directed E3 ligase that regulates axin degradation and Wnt signalling.</a> Nat Cell Biol. 13, 623-629 (2011).</li><li>Jackson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi.">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li><li>Birmingham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+UTR+seed+matches,+but+not+overall+identity,+are+associated+with+RNAi+off-targets.">3' UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets.</a> Nat Methods. 3, 199-204 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whither+RNAi.">Whither RNAi.</a> Nat Cell Biol. 5, 489-490 (2003).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El uso de pantallas de siRNA en todo el genoma de células de mamíferos se ha demostrado ser de gran valor en la identificación de nuevos reguladores de las vías biológicas distintas. Aquí, hemos descrito el uso de una pantalla de ARNsi ubiquitome dirigido a identificar reguladores de la respuesta celular mediada por HIF1A a la hipoxia. Pantallas dirigidas están volviendo cada vez más atractivo, ya que son generalmente más baratos, más rápidos, más fáciles de manejar y un informe sólo sobre los componentes ...

La modificación de proteínas con ubiquitina y ubiquitina-como las moléculas (Ubls) representa un sistema bioquímico expansiva que regula diversos procesos biológicos y las respuestas al estrés. La unión covalente de UBLs a sus proteínas diana puede tener diversos resultados que regulan la estabilidad, la localización, función o interactoma del sustrato 1. Los pasos enzimáticos subyacentes UBL modificación se establecieron por primera vez para la ubiquitina, y ahora sirven como paradigma para la modificación con la mayoría de UBLs, incluyendo SUMO, NEDD8, ISG15 y FAT10. Para que se produzca la modificación, el grupo carboxilato del motivo diglicina UBL se activa por primera vez por una enzima de activación E1 para formar un tiol de alta energía que se transfiere a la cisteína del sitio activo de una enzima de conjugación E2. El E2 entonces interactúa con un E3 ligase sustrato determinado para mediar la transferencia de la LBM en (generalmente) un residuo de lisina objetivo la creación de una cadena ramificada (isopeptídico) vinculación 2. Las rondas sucesivas de modificación pueden ocurrir para construir cadenas isopeptídicos sobre el sustrato, que para la ubiquitina puede ocurrir a través de cualquiera de sus siete lisinas, o a través de su metionina N-terminal para crear cadenas de ubiquitina lineales. Estas modificaciones forman topologías discretas con diversos fines, tales como la creación de nuevos motivos de interacción y dirigir proteínas para la degradación antes de la remoción UBL por proteasas especializados. En el caso de la ubiquitina hay dos enzimas E1, E2 30-40 enzimas de conjugación, al menos 600 ligasas E3 y aproximadamente 100 enzimas deubiquitylating (DUBS). Mientras que las vías son menos expansiva para las otras 10 o así UBLs, la complejidad general ubiquitome ofrece gran diversidad en el resultado biológico de una modificación particular UBL. Sin embargo, mientras que los principales avances de la biología UBL se han hecho, las funciones celulares precisas de la mayoría de estos componentes ubiquitome siguen siendo desconocidos. El uso de short interfering ácido ribonucleico (siRNAs) ha emergido como una herramienta poderosa en la genética inversa, debido a la capacidad de los siRNAs para dirigirse específicamente a los ARNm celulares para la destrucción, permitiendo que el papel de los genes individuales que se examinó en diferentes contextos biológicos 3. Pantallas de todo el genoma se han utilizado para identificar y validar nuevos reguladores de muchos procesos celulares, y han creado una gran cantidad de datos útiles al alcance de la comunidad científica en general. Sin embargo, mientras que las pantallas de todo el genoma han demostrado ser extremadamente útil, pantallas específicas son cada vez más populares, ya que son más baratos, más rápidos implican menos la gestión de datos y un informe sólo sobre los miembros del genoma en el que el investigador está más interesado. Por lo tanto, para entender mejor los componentes de la familia los procesos celulares UBL están involucrados en, hemos recopilado una biblioteca humana siRNA dirigido todos los conocidos y predijo componentes del ubiquitome. Esto incluye los UBLs, la activación de enzimas E1, E2 conjugaciónenzimas, ligasas E3, dominio de unión a ubiquitina (UBD) que contienen proteínas y DUBs. Esta biblioteca se puede utilizar para la pantalla contra una amplia gama de líneas celulares indicadoras de problemas biológicos distintos, permitiendo así la identificación imparcial de componentes UBL novedosos que rigen estas vías. El siguiente protocolo describe cómo realizar una rigurosa siRNA dirigidos ubiquitome pantalla para identificar nuevos reguladores de la respuesta HIF1A dependiente a la hipoxia. Bajo la tensión de oxígeno normal, HIF1A está sujeta a hidroxilación prolilo que hace que sea reconocida y destinada a la degradación por el Von Hippel Lindau (VHL) E3 ligase complejo 4. La hipoxia inhibe la hidroxilación prolil que conduce a la estabilización de HIF1A y su posterior unión a elementos de respuesta a la hipoxia (HRE) para conducir la expresión de genes. Aquí, se describe una pantalla utilizando células de osteosarcoma U20S de forma estable que expresa luciferasa de luciérnaga bajo el control de tres copias en tándem de la Hypoxia Elemento de Respuesta (células U20S-HRE) 5. Este protocolo se puede adaptar para cualquier vía biológica si un robusto lectura de salida de la actividad del indicador es alcanzable y se puede acoplar con controles positivos y negativos apropiados.

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	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:288px;">Automated Liquid Dispenser</td>
			<td style="width:147px;">Fluid-X</td>
			<td style="width:200px;">XPP-721</td>
			<td style="width:156px;">http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Automated cell counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
			<td>http://www.nexcelom.com/Cellometer-Auto-T4/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hypoxia Workstation</td>
			<td>Ruskin</td>
			<td>In vivo2 300</td>
			<td>http://www.ruskinn.com/products/invivo2300</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Automated Cell Dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Matrix Wellmate</td>
			<td>http://www.matrixtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=11</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Plate Shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Titramax 1000</td>
			<td>http://www.heidolph-instruments.co.uk/products/shakers-mixers/platform-shakers/vibrating/titramax/titramax-1000/</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Luminometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Envision 2104 Multilabel Reader</td>
			<td>http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Family/ID/EnVision%20Multilabel%20Plate%20Readers</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">White Walled Assay Plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655083</td>
			<td>http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Clear Plate Film</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1450-461</td>
			<td>http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Name of the Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">siRNA library</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>On-Target Plus</td>
			<td>http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Lipofectamine RNAimax</td>
			<td>http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Reduced Serum Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Optimem</td>
			<td>http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039#</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product#</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tryspin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product#</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sirna screening to identify ubiquitin and ubiquitin-like system regulators of biological pathways in cultured mammalian cells

Modificación posterior a la traducción de las proteínas con ubiquitina y ubiquitina-como las moléculas (Ubls) se está convirtiendo en una red de señalización celular dinámica que regula diversos procesos biológicos, incluyendo la respuesta a la hipoxia, proteostasis, la respuesta al daño del ADN y la transcripción. Para entender mejor cómo UBLs regulan las vías pertinentes a la enfermedad humana, hemos recopilado un siRNA humana &quot;ubiquitome&quot; biblioteca que consta de 1.186 piscinas siRNA dúplex dirigidos todos conocidos y predijo componentes de las vías del sistema de UBL. Esta biblioteca se puede criba frente a una gama de líneas celulares que expresan los reporteros de diversas vías biológicas para determinar qué componentes UBL actúan como reguladores positivos o negativos de la vía en cuestión. Aquí se describe un protocolo que utiliza esta biblioteca para identificar ubiquitome-reguladores de la respuesta celular mediada HIF1A a la hipoxia mediante un indicador de luciferasa basado en la transcripción. Una etapa inicial de desarrollo de ensayosse lleva a cabo para establecer los parámetros de detección adecuados de la línea celular antes de realizar la pantalla en tres etapas: detección / deconvolución primaria, secundaria y terciaria. El uso de objeto a través de siRNA bibliotecas de todo el genoma se está convirtiendo cada vez más popular, ya que ofrece la ventaja de la cobertura del sólo miembros de la vía con la que los investigadores están más interesados. A pesar de las limitaciones inherentes de la detección siRNA, en particular, los falsos positivos causados ​​por siRNA fuera de objetivo efectos, la identificación de auténticos nuevos reguladores de las vías en cuestión superan estas deficiencias, que pueden ser superadas mediante la realización de una serie de experimentos de control llevadas a cabo cuidadosamente.

Antes de la detección, se establece la hipoxia-respuesta de las células U20S-HRE. Células U20S-HRE expresan un constructo indicador que consiste en la luciferasa de luciérnaga fundida aguas abajo de tres copias en tándem del elemento de respuesta a la hipoxia, que está obligado por el heterodímero HIF1A/HIF1B tras la exposición a la hipoxia (Figura 1A). Las células se colocan en una estación de trabajo hipoxia para una serie de veces para establecer que la exposición hipoxia produce la respue...

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siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Aquí se describe una metodología para llevar a cabo un siRNA dirigidos pantalla &quot;ubiquitome&quot; para identificar nuevos ubiquitina y reguladores-ubiquitina de la respuesta celular mediada HIF1A a la hipoxia. Esto puede ser adaptado a cualquier vía biológica, donde una lectura robusta de la actividad del indicador está disponible.

Screening siRNA para identificar ubiquitina y reguladores del sistema ubiquitina-como de las vías biológicas en células de mamífero en cultivo

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

sirna-screening-to-identify-ubiquitin-ubiquitin-like-system

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K vistas.  University of Dundee.  Aquí se describe una metodología para llevar a cabo un siRNA dirigidos pantalla "ubiquitome" para identificar nuevos ubiquitina y reguladores-ubiquitina de la respuesta celular mediada HIF1A a la hipoxia. Esto puede ser adaptado a cualquier vía biológica, donde una lectura robusta de la actividad del indicador está disponible. 

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Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Detección rápida homogénea de Ensayos Biológicos Usando el Sistema de modulación magnética biosensores

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Investigación

Biología

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

MISIÓN esiRNA sobre el cribado del ARNi en células de mamífero

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

LentiPlex MISIÓN combinados de detección del shRNA biblioteca en células de mamífero

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

El aislamiento de los ribosomas polipéptidos nacientes Bound<em&gt; In vitro</em&gt; Para la identificación de sitios de traslación pausa a lo largo del ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, and multiwell-based assays are used to measure transcription factor activity. However, these assays are nonquantitative, lack specificity, may involve the use of radiolabeled oligonucleotides, and may not be adaptable for the screening of inhibitors of DNA binding. On the other hand, using a quantitative DNA-binding enzyme-linked immunosorbent assay (D-ELISA) assay, we demonstrate nuclear protein interactions with DNA using the RUNX2 transcription factor that depend on specific association with consensus DNA-binding sequences present on biotin-labeled oligonucleotides. Preparation of cells, extraction of nuclear protein, and design of double stranded oligonucleotides are described. Avidin-coated 96-well plates are fixed with alkaline buffer and incubated with nuclear proteins in nucleotide blocking buffer. Following extensive washing of the plates, specific primary antibody and secondary antibody incubations are followed by the addition of horseradish peroxidase substrate and development of the colorimetric reaction. Stop reaction mode or continuous kinetic monitoring were used to quantitatively measure protein interaction with DNA. We discuss appropriate specificity controls, including treatment with non-specific IgG or without protein or primary antibody. Applications of the assay are described including its utility in drug screening and representative positive and negative results are discussed.

We developed a quantitative DNA-binding, ELISA-based assay to measure transcription factor interactions with DNA. High specificity for the RUNX2 protein was achieved with a consensus DNA-recognition oligonucleotide and specific monoclonal antibody. Colorimetric detection with an enzyme-coupled antibody substrate reaction was monitored in real time.

Un ensayo cuantitativo para estudiar proteínas: DNA Interacciones, reguladores Descubra transcripcional de la expresión génica, e identificar agentes antitumoral

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking metabolism and inflammation (e.g.&#160;hepatic steatosis)1,2. There has been much progress in the identification of agonist ligands for PXR, however, there are limited descriptions of drug-like antagonists and their binding sites on PXR3,4,5. A critical barrier has been the inability to efficiently purify full-length protein for structural studies with antagonists despite the fact that PXR was cloned and characterized in 1998. Our laboratory developed a novel high throughput yeast based two-hybrid assay to define an antagonist, ketoconazole&#39;s, binding residues on PXR6. Our method involves creating mutational libraries that would rescue the effect of single mutations on the AF-2 surface of PXR expected to interact with ketoconazole. Rescue or &#34;gain-of-function&#34; second mutations can be made such that conclusions regarding the genetic interaction of ketoconazole and the surface residue(s) on PXR are feasible. Thus, we developed a high throughput two-hybrid yeast screen of PXR mutants interacting with its coactivator, SRC-1. Using this approach, in which the yeast was modified to accommodate the study of the antifungal drug, ketoconazole, we could demonstrate specific mutations on PXR enriched in clones unable to bind to ketoconazole. By reverse logic, we conclude that the original residues are direct interaction residues with ketoconazole. This assay represents a novel, tractable genetic assay to screen for antagonist binding sites on nuclear receptor surfaces. This assay could be applied to any drug regardless of its cytotoxic potential to yeast as well as to cellular protein(s) that cannot be studied using standard structural biology or proteomic based methods. Potential pitfalls include interpretation of data (complementary methods useful), reliance on single Y2H method, expertise in handling yeast or performing yeast two-hybrid assays, and assay optimization.

Ketoconazole binds to and antagonizes Pregnane X Receptor (PXR) activation. Yeast high throughput screens of PXR mutants define a unique region for ketoconazole binding. This yeast-based genetic method discovers novel nuclear receptor interactions with ligands that associate with surface binding sites.

Invierta levadura de dos sistema híbrido para identificar mamíferos Receptor Nuclear Residuos que interactúan con ligandos y / o antagonistas

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Ensayos Reporteros Massively Parallel en células de mamífero cultivadas

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imagen Ca Local<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en las células de mamífero en cultivo

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...