El protocolo tiene como objetivo simular in vivo las condiciones de degeneración del disco intervertebral para investigar su fisiopatología sin necesidad de modelos animales. En comparación con el cultivo celular in vitro, la técnica de cultivo de órganos biorreactor mantiene las células en su microambiente biológico y biomecánico nativo, además del suministro de una condición de cultivo controlable y reproducible. Comience con enjuagar toda la cola bovina a fondo con agua del grifo para eliminar la suciedad y el vello en la superficie, luego sumerja la cola en una solución de betadina al 1% durante 10 minutos para desinfectar la superficie.
Utilice un bisturí número 20 para extraer el tejido blando de la columna vertebral caudal para facilitar la identificación de los discos intervertebrales, o IVDs. Retire los procesos espinosos y transversales de las vértebras con un alicate de extracción ósea. Corte transversalmente con alicates óseos a través del centro de cada cuerpo vertebral para obtener segmentos de movimiento individuales, luego coloque los segmentos de movimiento recogidos en una placa de Petri con una gasa humedecida en la solución de Ringer.
Localice el IVD en las vértebras moviendo los segmentos de movimiento suavemente, luego identifique la ubicación de la placa de crecimiento tocando y encontrando el lado convexo de la placa final ósea. Enfríe la hoja de la sierra de cinta con la solución de Ringer y utilícese para hacer dos cortes paralelos en la placa de crecimiento de los IVDs, uno a cada lado. Transfiera los IVDs a una placa de Petri limpia con gasa limpia humedeceda con la solución de Ringer.
Raspe el cuerpo vertebral y la placa de crecimiento usando la hoja del bisturí, dejando la placa final intacta. Coloque las dos superficies planas y paralelas para el procedimiento de carga y transfiera los IVDs raspados a una placa de Petri fresca con gasa mojada con la solución de Ringer. Mida la altura y el diámetro del disco con una pinza, luego limpie los coágulos de sangre en el hueso de las vértebras con la solución de Ringer usando un sistema de lavado de chorro.
Desinfecte los IVDs en PBS y estreptomicina al 10% de penicilina con agitación durante 15 minutos. Enjuague los antibióticos de alta concentración con PBS y estreptomicina de penicilina al 1%. Transfiera discos a cámaras IVD que contengan cinco mililitros de medio de cultivo IVD y colóquelos en el sistema de biorreactores con una incubadora a 37 grados Celsius con 85% de humedad y 5% de dióxido de carbono.
Cultíe los discos durante cuatro días dentro de un sistema de biorreactor manteniendo diferentes condiciones de carga según los grupos experimentales. En el grupo de control fisiológico, cultivo de los IVDs con medio de glucosa alta utilizando un protocolo de carga de 0,02 a 0,2 megapascales y 0,2 hercios durante dos horas al día. En el grupo patológico, cultivar los IVDs con medio bajo en glucosa utilizando un protocolo de carga de 0,32 a 0,5 megapascales y cinco hercios durante dos horas al día.
Entre los procedimientos de carga, coloque los IVDs en placas de seis pozos con siete mililitros de medio de cultivo de IVD para la recuperación de hinchazón libre. Mida la altura del disco diariamente con una pinza después del período de hinchazón libre y después de la carga dinámica durante la duración experimental. Después del primer ciclo de carga dinámica en el primer día, coloque directamente los IVDs en una placa de Petri en una posición vertical y estabilicelos con una pinza.
Inyecte TNF-alfa recombinante con una aguja de insulina de calibre 30 lentamente a una velocidad de aproximadamente 70 microlitros por minuto en los IVDs del grupo patológico. Después de inyectar, tire de la jeringa hacia atrás y tire del émbolo para crear un vacío que evite que la solución inyectada se escape, luego retire la jeringa completamente del IVD. El cargamento degenerativo combinado con la fuente limitada de la nutrición y una inyección de la TNF-alfa causó un aumento significativo en la expresión génica del interleukin favorable-inflamatorio seises de los marcadores y del interleukin ocho en tejido del NP después de cuatro días de cultura.
El lanzamiento de la proteína del interleukin ocho en el medio condicionado demostró un aumento marcado en el grupo patológico el el día dos y el día cuatro. La reducción de la altura del disco después de la carga fue mayor en el grupo patológico en comparación con el grupo fisiológico, y las diferencias fueron más pronunciadas después de los días dos y tres en comparación con el primer día, lo que indica un efecto progresivo de las condiciones degenerativas e inflamatorias. Una técnica estandardizada de la disección es importante para los modelos reproducibles de la cultura del entero-órgano de IVD.
Se requiere un biorreactor para aplicar cargas fisiológicas y degenerativas en los IVDs para simular varias condiciones biomecánicas in vivo. Esta técnica se puede aplicar en los explantes humanos de IVD que está de alta importancia clínica. Es un nuevo modelo preclínico para desarrollar tratamientos efectivos en la degeneración del disco en etapa temprana.
