Este protocolo automatizado permite la preparación histopatológica de tejidos murino con sistemas robóticos utilizados habitualmente para el procesamiento e incrustación de muestras humanas, aumentando en gran medida la calidad de las muestras. Las principales ventajas de esta técnica, son que reduce el número de variables metodológicas y mejora la estandarización de los pasos procesales. Demostrando el procedimiento, será Francesca Boggio.
Francesca Boggio es una patóloga que trabaja en mi laboratorio. Comience usando pequeñas pinzas para transferir las muestras fijas de tejido del colon murino de la formalina tamponada neutra, a una placa de trabajo de seccionamiento en una placa de Petri. Usa un bisturí estéril para cortar el colon en fragmentos de 0,2 a 0,3 centímetros, y usa las pinzas para colocar un segmento en cada una de las tres puntas de plástico no adyacentes que sobresalen de un cassette orientado a la incrustación de parafina.
Empuje cuidadosamente los cuatro bordes para cerrar el cassette e inserte la rejilla en un marco de soporte de plástico. A continuación, etiquete el marco de soporte para identificar la muestra y transfiera el cassette a la cuadrícula. Una hora antes del procesamiento, gire el procesador automatizado.
Cuando el instrumento indique que la parafina se ha derretido, inserte manualmente la cesta metálica en el procesador automatizado. Cuando se hayan insertado todos los cassettes, cierre la cesta y abra la tapa de la réplica. Inserte la cesta en la carcasa dedicada del procesador y cierre la tapa de la réplica.
Utilice la pantalla táctil del ordenador del instrumento para definir el protocolo de trabajo seleccionando la secuencia de soluciones, la sincronización y la temperatura, que se implementarán de acuerdo con el esquema proporcionado en la tabla. Haga clic en el icono del ordenador dedicado para asignar el protocolo a la réplica que contiene la cesta del cassette y haga clic en el botón de inicio. Cuando el instrumento confirme el final del protocolo con un icono dedicado y un tono de alarma, abra la tapa de la réplica y retire la cesta del procesador.
Una hora antes de la incrustación del tejido, encienda el embedder automatizado y espere hasta que la parafina se derrita por completo como lo indica el termómetro de baño de parafina en el instrumento. Transfiera manualmente hasta 32 casetes procesados desde la cesta del procesador al bastidor de incrustación y abra la tapa principal del incrustador. Utilice la pantalla táctil para indicar al sistema robótico que se está insertando un bastidor y abrir la tapa de la carcasa de entrada.
Inserte hasta cuatro bastidores en la carcasa de entrada y cierre la tapa de la carcasa de entrada. A continuación, utilice la pantalla táctil para iniciar el procedimiento de incrustación como se indica en la tabla. Cuando el instrumento confirme el final del protocolo con el icono dedicado, retire el bastidor de salida y cierre la tapa principal del incrustador.
A continuación, transfiera los bloques incrustados desde el bastidor a una caja de almacenamiento. El acortamiento del colon, y la expresión colónica de genes pro inflamatorios, son parámetros ampliamente utilizados para puntuar la presencia de sulfato de sodio dextrano o inflamación inducida por DSS. La infiltración de células inflamatorias en la lámina intestinal propria también se mejora en gran medida por el tratamiento DSS.
La tinción de H&E de muestras no tratadas procesadas por automatización como se ha demostrado, revela menos células inflamatorias infiltrantes, alteraciones epiteliales y cambios en la arquitectura de la mucosa en comparación con las muestras de animales tratados con DSS. La calidad de la preparación y la incrustación del tejido murino realizada por los instrumentos automatizados puede ser confirmada adicionalmente por tinción inmunohistoquímica para CD20 y Mallory Trichrome Staining. En particular, el procesamiento automatizado de muestras permite consistentemente la evaluación de una mayor proporción de parámetros histológicos, que las muestras procesadas por el método manual.
Tenga cuidado de insertar correctamente el tejido en la rejilla para esperar a que el procesador automatizado esté listo, y esperar a que la parafina se derrita por completo. Este método se puede utilizar para realizar análisis histológicos de cualquier tejido murino, con el qualitive de muestras histológicas humanas que se utilizarán en modelos murinos de patólogos humanos. Esta técnica ya ha sido un estudio exitoso para el estudio de la inflamación del tejido inflamatorio, y será útil para el estudio de modelos de cáncer murino colorrectal.
Como algunos reactivos utilizados en este protocolo son peligrosos, recuerde usar siempre guantes de protección, gafas y una capa de laboratorio al realizar este procedimiento.
