La implantación de células de osteosarcoma dentro del microambiente de la tibia promueve la metástasis pulmonar. Este modelo también puede ser útil para estudiar los mecanismos de la metástasis pulmonar o las nuevas terapias contra el cáncer que requieren un sistema inmunitario intacto. Una vez que se ha establecido el tumor, la amputación es necesaria para controlar la tasa de metástasis en estudios de supervivencia a largo plazo.
Utilizamos las inyecciones yugulares para permitir la visualización de la administración intravenosa de fármacos. La inyección de la vena yugular es útil para muchos otros modelos de enfermedad para los que se requiere una administración precisa de medicamentos. Hemos utilizado este método para administrar nanopartículas y liganes radiomarcados para imágenes in vivo.
Aconsejamos a los nuevos usuarios que practiquen la extirpación de una extremidad de cinco a 10 ratas sacrificadas antes de intentar un experimento para dominar la mecánica de la amputación de extremidades sin pérdida de sangre. Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pene, asegure la rata anestesiada en una nariz en una almohadilla térmica de ajuste a baja temperatura en posición supina. Retire el vello de la pierna derecha, hasta el abdomen ventral y dorsal inferior.
Use una gasa o aerosol para desinfectar el área quirúrgica con etanol al 70% y un antiséptico diluido apropiado y aplique ungüento en los ojos del animal. Usando un movimiento similar a un taladro para hacer una abertura, inserte una aguja de calibre 22 marcada a 10 milímetros de la punta 10 milímetros en la diáfisis de la tibia en el medio de la meseta tibial, extendiendo la aguja a través de la metáfisis hasta la diáfisis. Después de retirar la aguja, mezcle suavemente la suspensión de células tumorales de interés para obtener una suspensión celular homogénea, y cargue 7.5 x 10 a la cuarta de las células en 20 microlitros de PBS en una jeringa Hamilton.
Marque la jeringa Hamilton con celdas a 10 milímetros de la punta de la aguja e inserte la aguja en la marca de 10 milímetros en el orificio hecho por la aguja de calibre 22. Luego descargue suavemente todo el volumen de células en la cavidad de la médula y coloque a la rata en una jaula en una almohadilla térmica con monitoreo hasta la recostada completa. Para la administración intravenosa de doxorrubicina, después de la confirmación de la anestesia, use una disección cuidadosa para visualizar la vena yugular derecha o izquierda, e inserte la aguja en el tejido muscular suprayacente.
Dirija la aguja hacia la cabeza hacia la luz de la vena yugular, tal como se visualiza en la vena yugular anterior al músculo pectoral, y extraiga un pequeño volumen de sangre en la punta de la aguja para confirmar una inserción precisa. Cuando la aguja esté en su lugar, inyecte lentamente de 100 a 150 microlitros de dos miligramos por kilogramo de doxorrubicina durante un minuto. La solución debe ser visible dentro de la vena durante el parto.
Cuando se haya administrado toda la solución, use una gasa estéril para aplicar una presión suave a la vena y use de tres a cuatro clips para la herida para cerrar la incisión. Después de confirmar la sedación, retire el vello de la pierna derecha, hasta el ventral y la parte inferior del abdomen dorsal, y coloque a la rata en posición supina sobre una almohadilla térmica. Frote la piel desde la mitad de la pantorrilla hasta justo por encima de la articulación de la cadera de la parte inferior derecha del abdomen como se demuestra y aplique ungüento a los ojos del animal.
Usando guantes e instrumentos estériles, tire de la pierna a través de la ventilación de la cortina quirúrgica estéril y haga una incisión cutánea circunferencial justo proximal a la asfixia. Desenga la extremidad posterior para exponer la arteria femoral y la vena en la superficie ventral-medial de la extremidad posterior, y use suturas absorbibles 4-0 para litigar los vasos a nivel del fémur medio y el transecto distalmente. Sujete la vena distalmente para reducir las fugas durante la disección muscular y use la disección roma para abducir la articulación de la cadera con rotación lateral hacia afuera.
Localice y desarticule la cabeza del fémur del acetábulo y elimine cualquier tejido restante, manteniendo la pierna unida al cuerpo. Administre un bloque de salpicaduras al acetábulo y al nervio ciático con aproximadamente seis miligramos por kilogramo de ropivacaína, y use una sutura absorbible simple interrumpida 4-0 para cerrar la musculatura sobre el acetábulo. Luego use clips de herida colocados de cinco a 10 milímetros para cerrar los bordes de la piel.
Las imágenes de rayos X para la vigilancia del tumor permiten la confirmación de la invasión del tumor óseo y se pueden realizar en extremidades recientemente amputadas o fijadas con formalina. Las imágenes de rayos X también permiten evaluar la morfología radiográfica de los pulmones con y sin metástasis, proporcionando un método rápido y fácil para determinar la necesidad de eutanasia para prevenir muertes espontáneas innecesarias. En el osteosarcoma de rata, tanto la morfología del tumor osteolítico como el osteoblástico pueden confirmarse mediante histopatología de la extremidad amputada.
Tenga en cuenta que el hueso cortical está ausente en este ejemplo y que el hueso adyacente ha sido reemplazado o fortificado por un nuevo hueso tejido que está orientado perpendicularmente al eje existente de la corteza. También se pueden identificar islas de osteoides inmaduros dentro del tumor. En estas imágenes se observa la morfología microscópica de metástasis pulmonares representativas, algunas con hueso mineralizado y émbolos vasculares tumorales.
La inmunotinción de los tumores primarios de osteosarcoma puede revelar la infiltración de los tumores por poblaciones de células inmunitarias, como los macrófagos CD68 positivos o las células T CD3 positivas. Western blotting de lisados de proteínas de células tumorales se puede utilizar para determinar la expresión de proteínas quinasas, receptores de proteína quinasa y otras proteínas que interactúan con estas vías. Para la implantación tibial, una vez que se haya hecho el primer orificio tibial, continúe sosteniendo la pierna en su mano no dominante en el mismo ángulo para mantener la piel y los orificios óseos alineados para facilitar la inserción de la aguja hamilton.
Para la inyección yugular, inserte la aguja en el músculo, pero no incline demasiado la aguja para evitar perder la vena. Para la amputación, practique primero la desarticulación en ratas sacrificadas.
