L'impianto di cellule di osteosarcoma all'interno del microambiente della tibia promuove le metastasi polmonari. Questo modello può anche essere utile per studiare i meccanismi delle metastasi polmonari o di nuove terapie antitumorali che richiedono un sistema immunitario intatto. Una volta che il tumore è stato stabilito, l'amputazione è necessaria per controllare il tasso di metastasi negli studi di sopravvivenza a lungo termine.
Utilizziamo le iniezioni giugulari per consentire la visualizzazione della somministrazione endovenosa di farmaci. L'iniezione di vena giugulare è utile per molti altri modelli di malattia per i quali è richiesta una consegna precisa del farmaco. Abbiamo utilizzato questo metodo per fornire nanoparticelle e ligani radiomarcati per l'imaging in vivo.
Consigliamo ai nuovi utenti di esercitarsi a rimuovere un arto da cinque a 10 ratti eutanasizzati prima di tentare un esperimento per padroneggiare la meccanica dell'amputazione degli arti senza perdita di sangue. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pene, fissare il ratto anestetizzato in un naso su un cuscinetto termico a bassa temperatura in posizione supina. Rimuovere i peli sulla gamba destra, fino all'addome inferiore ventrale e dorsale.
Utilizzare una garza o uno spray per disinfettare l'area chirurgica con etanolo al 70% e un antisettico diluito appropriato e applicare un unguento agli occhi dell'animale. Usando un movimento simile a un trapano per fare un'apertura, inserisci un ago calibro 22 contrassegnato a 10 millimetri dalla punta a 10 millimetri nella diafisi della tibia nel mezzo del plateau tibiale, estendendo l'ago attraverso la metafisi nella diafisi. Dopo aver rimosso l'ago, mescolare delicatamente la sospensione delle cellule tumorali di interesse per ottenere una sospensione cellulare omogenea e caricare 7,5 x 10 alla quarta delle cellule in 20 microlitri di PBS in una siringa hamilton.
Contrassegnare la siringa Hamilton con celle a 10 millimetri dalla punta dell'ago e inserire l'ago al segno di 10 millimetri nel foro praticato dall'ago calibro 22. Quindi scaricare delicatamente l'intero volume di cellule nella cavità del midollo e posizionare il ratto in una gabbia su una piastra riscaldante con monitoraggio fino alla completa reclinazione. Per la somministrazione endovenosa di doxorubicina, dopo la conferma dell'anestesia, utilizzare un'attenta dissezione per visualizzare la vena giugulare destra o sinistra e inserire l'ago nel tessuto muscolare sovrastante.
Dirigere l'ago verso la testa nel lume della vena giugulare, come viene visualizzato nella vena giugulare anteriore al muscolo pettorale, e prelevare un piccolo volume di sangue nella punta dell'ago per confermare un inserimento accurato. Quando l'ago è in posizione, iniettare lentamente da 100 a 150 microlitri di due milligrammi per chilogrammo di doxorubicina nell'arco di un minuto. La soluzione deve essere visibile all'interno della vena durante il parto.
Quando tutta la soluzione è stata erogata, utilizzare una garza sterile per applicare una leggera pressione sulla vena e utilizzare da tre a quattro clip per ferite per chiudere l'incisione. Dopo aver confermato la sedazione, rimuovere i peli sulla gamba destra, fino all'addome inferiore ventrale e dorsale, e posizionare il ratto in posizione supina su una piastra riscaldante. Strofinare la pelle dal centro del polpaccio a poco sopra l'articolazione dell'anca dell'addome inferiore destro come dimostrato e applicare un unguento agli occhi dell'animale.
Usando guanti e strumenti sterili, tirare la gamba attraverso lo sfiato del drappo chirurgico sterile e fare un'incisione cutanea circonferenziale appena prossimale al soffocamento. Deglove l'arto posteriore per esporre l'arteria femorale e la vena sulla superficie ventrale-mediale dell'arto posteriore e utilizzare 4-0 suture assorbibili per litigare i vasi a livello del femore medio e transect distalmente. Bloccare la vena distalmente per ridurre le perdite durante la dissezione muscolare e utilizzare la dissezione smussata per rapire l'articolazione dell'anca con rotazione laterale verso l'esterno.
Individuare e disarticolare la testa del femore dall'acetabolo e rimuovere qualsiasi tessuto rimanente, mantenendo la gamba attaccata al corpo. Somministrare un blocco di spruzzi all'acetabolo e al nervo sciatico con circa sei milligrammi per chilogrammo di ropivacaina e utilizzare una semplice sutura assorbibile 4-0 interrotta per chiudere la muscolatura sopra l'acetabolo. Quindi utilizzare clip avvolte posizionate da cinque a 10 millimetri per chiudere i bordi della pelle.
L'imaging a raggi X per la sorveglianza tumorale consente la conferma dell'invasione tumorale ossea e può essere eseguita su arti recentemente amputati o fissati con formalina. L'imaging a raggi X consente anche la valutazione della morfologia radiografica dei polmoni con e senza metastasi, fornendo un metodo rapido e semplice per determinare la necessità di eutanasia per prevenire inutili morti spontanee. Nell'osteosarcoma del ratto, la morfologia del tumore osteolitico e osteoblastico può essere confermata dall'istopatologia dell'arto amputato.
Si noti che l'osso corticale è assente in questo esempio e che l'osso adiacente è stato sostituito o fortificato da un nuovo osso tessuto orientato perpendicolarmente all'albero esistente della corteccia. Isole di osteoidi immaturi possono anche essere identificate all'interno del tumore. In queste immagini si può osservare la morfologia microscopica di metastasi polmonari rappresentative, alcune con emboli vascolari ossei mineralizzati e tumorali.
L'immunocolorazione dei tumori primari dell'osteosarcoma può rivelare l'infiltrazione dei tumori da parte di popolazioni di cellule immunitarie, come i macrofagi CD68-positivi o le cellule T CD3-positive. Il western blotting dei lisati proteici delle cellule tumorali può essere utilizzato per determinare l'espressione di chinasi proteiche, recettori delle protein chinasi e altre proteine che interagiscono con questi percorsi. Per l'impianto tibiale, una volta effettuato il primo foro tibiale, continuare a tenere la gamba nella mano non dominante con la stessa angolazione per mantenere la pelle e i fori ossei allineati per facilitare l'inserimento dell'ago Hamilton.
Per l'iniezione giugulare, inserire l'ago nel muscolo, ma non angolare troppo l'ago per evitare di perdere la vena. Per l'amputazione, praticare prima la disarticolazione sui ratti eutanasizzati.
