Die Implantation von Osteosarkomzellen in die Mikroumgebung der Tibia fördert die Lungenmetastasierung. Dieses Modell kann auch nützlich sein, um die Mechanismen der Lungenmetastasierung oder neuartige Krebstherapien zu untersuchen, die ein intaktes Immunsystem erfordern. Sobald der Tumor festgestellt wurde, ist eine Amputation notwendig, um die Metastasenrate in Langzeitüberlebensstudien zu kontrollieren.
Wir verwenden die Jugularinjektionen, um die Visualisierung der intravenösen Medikamentenabgabe zu ermöglichen. Die Injektion der Jugularvenen ist für viele andere Krankheitsmodelle nützlich, für die eine präzise Medikamentenabgabe erforderlich ist. Wir haben diese Methode verwendet, um Nanopartikel und radioaktiv markierte Ligane für die In-vivo-Bildgebung zu liefern.
Wir empfehlen neuen Benutzern, das Entfernen eines Glieds von fünf bis 10 eingeschläferten Ratten zu üben, bevor sie ein Experiment versuchen, um die Mechanik der Amputation von Gliedmaßen ohne Blutverlust zu meistern. Nachdem Sie eine mangelnde Reaktion auf den Penisreflex bestätigt haben, sichern Sie die betäubte Ratte in einem Nasenkegel auf einem Wärmekissen mit niedriger Hitzeeinstellung in Rückenlage. Entfernen Sie die Haare am rechten Bein bis zum ventralen und dorsalen Unterbauch.
Verwenden Sie Gaze oder Spray, um den Operationsbereich mit 70% Ethanol und einem geeigneten verdünnten Antiseptikum zu desinfizieren und Salbe auf die Augen des Tieres aufzutragen. Führen Sie mit einer bohrerähnlichen Bewegung, um eine Öffnung zu machen, eine 22-Gauge-Nadel ein, die 10 Millimeter von der Spitze 10 Millimeter markiert ist, in die Diaphyse der Tibia in der Mitte des Tibiaplateaus und verlängern Sie die Nadel durch die Metaphyse in die Diaphyse. Nachdem Sie die Nadel entfernt haben, mischen Sie vorsichtig die interessierende Tumorzellsuspension, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten, und laden Sie 7,5 x 10 bis zur vierten der Zellen in 20 Mikroliter PBS in eine Hamilton-Spritze.
Markieren Sie die Hamilton-Spritze mit Zellen 10 Millimeter von der Nadelspitze und führen Sie die Nadel bis zur 10-Millimeter-Marke in das Loch der 22-Gauge-Nadel ein. Führen Sie dann vorsichtig das gesamte Zellvolumen in die Markhöhle ab und legen Sie die Ratte in einen Käfig auf einem Heizkissen mit Überwachung bis zum vollen Liegestuhl. Für die intravenöse Doxorubicin-Verabreichung verwenden Sie nach der Bestätigung der Anästhesie eine sorgfältige Dissektion, um die rechte oder linke Jugularvene zu visualisieren, und führen Sie die Nadel in das darüber liegende Muskelgewebe ein.
Richten Sie die Nadel in Richtung Kopf in das Jugularvenenlumen, wie es in der Jugularvene vor dem Musculus pectoralis sichtbar ist, und ziehen Sie ein kleines Blutvolumen in die Nadelspitze, um eine genaue Einführung zu bestätigen. Wenn die Nadel an Ort und Stelle ist, injizieren Sie langsam 100 bis 150 Mikroliter von zwei Milligramm pro Kilogramm Doxorubicin über eine Minute. Die Lösung sollte während der Entbindung in der Vene sichtbar sein.
Wenn die gesamte Lösung geliefert wurde, verwenden Sie sterile Gaze, um sanften Druck auf die Vene auszuüben, und verwenden Sie drei bis vier Wundclips, um den Schnitt zu schließen. Entfernen Sie nach Bestätigung der Sedierung die Haare am rechten Bein bis zum ventralen und dorsalen Unterbauch und legen Sie die Ratte in Rückenlage auf ein Heizkissen. Schrubben Sie die Haut von der Mitte der Wade bis knapp über das Hüftgelenk des rechten Unterbauchs wie gezeigt und tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf.
Ziehen Sie das Bein mit sterilen Handschuhen und Instrumenten durch die Entlüftung des sterilen Operationsvorhangs und machen Sie einen umlaufenden Hautschnitt, der nur in der Nähe des Erstickens liegt. Deglove der Hintergliedmaße, um die Oberschenkelarterie und vene auf der ventral-medialen Oberfläche der Hintergliedmaße freizulegen, und verwenden Sie 4-0 resorbierbare Nähte, um die Gefäße auf Höhe des mittleren Femurs zu bewegen und distal zu transektieren. Klemmen Sie die Vene distal, um die Leckage während der Muskeldissektion zu reduzieren, und verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um das Hüftgelenk mit seitlicher Rotation nach außen zu entführen.
Lokalisieren und disartikulieren Sie den Kopf des Femurs aus dem Acetabulum und entfernen Sie das verbleibende Gewebe, wobei das Bein am Körper befestigt bleibt. Verabreichen Sie dem Acetabulum und dem Ischiasnerv einen Spritzblock mit etwa sechs Milligramm pro Kilogramm Ropivacain und verwenden Sie eine einfache unterbrochene 4-0 resorbierbare Naht, um die Muskulatur über dem Acetabulum zu schließen. Verwenden Sie dann Wundklammern, die fünf bis 10 Millimeter platziert sind, um die Hautränder zu schließen.
Die Röntgenbildgebung zur Tumorüberwachung ermöglicht die Bestätigung einer Knochentumorinvasion und kann an kürzlich amputierten oder formalinfixierten Gliedmaßen durchgeführt werden. Die Röntgenbildgebung ermöglicht auch die Beurteilung der radiologischen Morphologie der Lunge mit und ohne Metastasen und bietet eine schnelle und einfache Methode zur Bestimmung der Notwendigkeit einer Euthanasie, um unnötige spontane Todesfälle zu vermeiden. Beim Osteosarkom der Ratte kann sowohl die osteolytische als auch die osteoblastische Tumormorphologie durch Histopathologie der amputierten Extremität bestätigt werden.
Beachten Sie, dass der kortikale Knochen in diesem Beispiel fehlt und dass der benachbarte Knochen durch neuen gewebten Knochen ersetzt oder angereichert wurde, der senkrecht zum vorhandenen Schaft des Kortex ausgerichtet ist. Inseln unreifer Osteoide können auch innerhalb des Tumors identifiziert werden. In diesen Bildern kann die mikroskopische Morphologie repräsentativer Lungenmetastasen, einige mit mineralisierter Knochen- und Tumorgefäßembolie, beobachtet werden.
Die Immunfärbung von primären Osteosarkomtumoren kann die Infiltration der Tumore durch Immunzellpopulationen wie CD68-positive Makrophagen oder CD3-positive T-Zellen aufdecken. Western Blotting von Tumorzellproteinlysaten kann verwendet werden, um die Expression von Proteinkinasen, Proteinkinaserezeptoren und anderen Proteinen zu bestimmen, die mit diesen Signalwegen interagieren. Halten Sie bei der Tibiaimplantation, sobald das erste Tibialoch gemacht wurde, das Bein weiterhin in Ihrer nicht dominanten Hand im gleichen Winkel, um die Haut und die Knochenlöcher aufgereiht zu halten, um das Einführen der Hamilton-Nadel zu erleichtern.
Für die Jugularinjektion führen Sie die Nadel in den Muskel ein, aber winkeln Sie die Nadel nicht zu sehr an, um zu vermeiden, dass die Vene fehlt. Für die Amputation üben Sie zuerst die Disartikulation an eingeschläferten Ratten.
