Este protocolo permitirá a los investigadores responder preguntas importantes sobre los patrones neuronales de conectividad y organización espacial que subyacen a la función dentro de un circuito. La principal ventaja de esta técnica es que permite la visualización de morfologías neuronales ubicadas en lo profundo del tejido tridimensional intacto. Este método es sencillo y, por lo tanto, fácilmente reproducible.
Los experimentadores primerizos deben sentirse cómodos realizando esta técnica. Es imperativo tener una muestra de tejido clara para obtener datos de alta calidad. La demostración visual de la claridad adecuada de los tejidos y las técnicas de limpieza permitirán resultados fácilmente reproducibles.
Para comenzar, coloque el tejido cerebral sumergido en hidrogel en una incubadora de vacío durante tres horas a 37 grados centígrados con menos 90 kilopascales de vacío. Deje la parte superior del tubo desenroscado para permitir que el vacío se forme correctamente. Lave el pañuelo con PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente con un suave agitación.
Coloque la muestra de tejido polimerizado en la cámara de electroforesis, haciendo un seguimiento de la orientación del tejido dentro de la cámara. Llene la cámara y el depósito con el tampón SDS de electroforesis suministrado. Ejecute la muestra a 70 voltios, un amperio y 35 grados Celsius con corriente constante durante aproximadamente dos horas por mililitro de tejido.
Revise la muestra periódicamente para obtener suficiente limpieza del tejido cerebral retirándolo de la cámara y reemplazándolo en la misma orientación. Después de que la muestra haya terminado de limpiarse, lávela en PBS durante la noche a temperatura ambiente, reemplazando el PBS con PBS fresco con la mayor frecuencia posible. Después del lavado final en PBS, lave el pañuelo durante cinco minutos en agua desionizada a temperatura ambiente tres veces.
El tejido se volverá opaco y puede expandirse. Incubar el tejido en la solución de coincidencia de índice de refracción durante al menos cuatro horas a temperatura ambiente. Durante la incubación, construya una cámara de alojamiento adecuada para obtener imágenes de la muestra.
Comience usando un portaobjetos de vidrio como base para el montaje, luego colóquelos de goma o plástico y asegúrelos con súper pegamento, asegurándose de que no haya agujeros. Coloque el tejido transparente en la cámara de montaje precargada con una solución de coincidencia de índice de refracción. Monte el pañuelo de forma segura colocando una cubierta de vidrio en la parte superior y sellándolo con esmalte de uñas.
Imagine este tejido agregando una gota de solución de montaje de coincidencia de índice de refracción directamente sobre el vidrio. Para construir una cámara de imágenes de tejidos grandes para tejidos con más de cinco milímetros de grosor, use un plato de vidrio de 10 centímetros con una pared alta. Coloque un tubo cónico de 50 mililitros en el centro, asegurándose de que el diámetro del tubo sea lo suficientemente grande como para aceptar el barril de la lente objetivo utilizada.
Haga 3% de agarosa en agua y viértala en el espacio entre el plato de vidrio y el tubo cónico, luego deje que se enfríe durante una hora. Esto formará un anillo de agarosa sólida. Adhiera de forma segura el tejido a la parte inferior de la cámara con súper pegamento y llene la cámara con una solución de coincidencia de índice de refracción, que puede comenzar a polimerizarse a menos que se conserve del aire y se almacene a cuatro grados centígrados.
Adquirir la imagen utilizando un microscopio confocal. Encienda todos los equipos de imágenes relevantes. Coloque la muestra en el escenario.
Aborde cuidadosamente los medios de inmersión con el objetivo y forme una columna continua de medios. Usando epifluorescencia, encuentre un campo de imágenes apropiado. Comience por establecer la resolución y la velocidad de escaneo.
Si se obtienen imágenes con un microscopio confocal, cierre completamente el agujero de alfiler para obtener la sección óptica más pequeña y, por lo tanto, la mejor resolución Z. Aumente gradualmente la potencia del láser o la ganancia del sensor hasta obtener una imagen adecuada con una alta relación señal-ruido. Si utiliza imágenes estándar de dos colores EGFP o tdTomato, establezca la configuración de recolección de luz.
Establezca los parámetros de la pila Z en función de los puntos de inicio y final observados del tejido. Establezca el tamaño del paso en función de la resolución Z deseada. Los tamaños de paso más pequeños producirán una mayor resolución Z, pero pueden conducir al blanqueamiento de la muestra.
Cuando esté satisfecho con la configuración de adquisición de imágenes, adquiera la imagen. Asegúrese de que la imagen tenga una alta relación señal-ruido y muestre límites distintos de las estructuras. Después de la adquisición de la imagen, la morfología celular representativa se analizó utilizando estadísticas integradas y clasificando scripts dentro del software de análisis.
Los datos recopilados reflejan que la Neurona 2 tiene una estructura más grande que la dendrítica con una mayor densidad de espinas en comparación con la Neurona 1. Para corroborar este resultado, se realizó un análisis estándar de Scholl, que afirma que la Neurona 2 es más compleja dendríricamente que la Neurona 1 como se denota por el mayor número de intersecciones de Scholl a 50 a 100 micrómetros del soma. La neurona 1 contiene una mayor proporción de espinas con formas más parecidas a filopodias y es un subtipo de columna inmaduro.
Las espinas con cabezas definidas, llamadas espinas de hongo, probablemente contienen sinapsis más desarrolladas y maduras. Por lo tanto, la neurona 2 es más madura con una mayor densidad de espinas maduras. Después de la limpieza, los trozos de tejido se pueden teñir utilizando inmunohistoquímica tradicional.
