Este protocolo da como resultado una extracción de cromatina reproducible y confiable de muestras de hígado congeladas para experimentos de inmunoprecipitación de cromatina. Para comenzar, coloque el tubo que contiene el tejido congelado en el mortero y déjelo reposar allí durante cinco minutos. Luego aplique presión a la muestra usando un mortero preenfriado hasta que no haya más desmorones sólidos.
Retire el tubo que contiene la muestra del mortero. Agregue 950 microlitros de PBS helado con los inhibidores necesarios, y pipete hacia arriba y hacia abajo suavemente hasta que la muestra esté completamente resuspendida. Transfiera inmediatamente la suspensión de tejido al homogeneizador y aplique de 20 a 30 golpes con Pestle A para obtener una suspensión más fina.
Evite mover el mortero fuera de la fase líquida para evitar la formación de espuma. Transfiera el homogeneizado a un nuevo tubo de 1,5 mililitros previamente enfriado en hielo. Luego centrifugar el tubo durante cinco minutos a 1, 300 G y cuatro grados centígrados.
Retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet completamente en 950 microlitros de PBS a temperatura ambiente mediante un pipeteo suave. Luego agregue 63.6 microlitros de formaldehído libre de metanol al 16% para obtener una concentración final del 1%Gire inmediatamente el tubo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la rotación, agregue 113 microlitros de glicina molar 1.25 a temperatura ambiente para obtener una concentración final de 125 milimolares, y gire el tubo durante otros cinco minutos.
Luego centrifugar la muestra a 1, 300 G durante tres minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet con cuidado pipeteando en 950 microlitros de PBS helado con los inhibidores requeridos. Centrifugar la muestra de nuevo y resuspender el pellet como se demostró anteriormente.
Repita el paso de centrifugación una vez más y proceda inmediatamente al procedimiento de aislamiento de cromatina. Agregue 950 microlitros de tampón A con los inhibidores necesarios al pellet y mezcle suavemente pipeteando hasta que el pellet esté completamente resuspendido. Luego gire el tubo durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Después de la rotación, centrifugar la muestra a 2, 000 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y retire con cuidado el sobrenadante. Agregue 950 microlitros de tampón B con los inhibidores necesarios al pellet y mezcle suavemente pipeteando hasta que el pellet esté completamente resuspendido. Luego gire el tubo durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Después de la rotación, centrifugar la muestra de nuevo. Retire el sobrenadante. A continuación, añadir 300 microlitros de tampón C a temperatura ambiente con los inhibidores necesarios al pellet y pipetear vigorosamente.
Vórtice la muestra durante 15 a 30 segundos. Luego gire el tubo brevemente para recoger las gotas en la tapa. Después de sonicar la muestra de cromatina, agregue 30 microlitros de solución Triton X-100 al 10% y vórtice durante cinco a 10 segundos.
Centrifugar la muestra a 16, 000 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Y transfiera el sobrenadante a un tubo limpio de 1,5 mililitros preenfriado en hielo. Transfiera de 10 a 25 microlitros de cromatina cortada a un tubo nuevo y agregue tampón C para alcanzar un volumen final de 200 microlitros.
La alícuota y el choque congelan el resto de la cromatina a menos 80 grados centígrados hasta su uso posterior. Agregue ocho microlitros de cloruro de sodio molar y incube durante al menos seis horas a 65 grados centígrados en el bloque de calentamiento mientras agita a 1, 000 RPM. Extienda la incubación durante la noche si es posible.
Después de dejar que las muestras se enfríen a temperatura ambiente durante cinco minutos, agregue dos microlitros de RNasa A e incube durante una hora a 37 grados centígrados mientras agita a 1, 000 RPM. Retire las muestras del bloque de calentamiento y agregue siete microlitros de cloruro de calcio milimolar 300 y dos microlitros de proteinasa K.Incubar las muestras en el bloque de calentamiento a 56 grados centígrados durante 30 minutos mientras agita a 1, 000 RPM. Mientras tanto, prepare un tubo de separación de fase para cada muestra centrifugando hasta 16, 000 G durante un minuto a cuatro grados centígrados.
Después de retirar los tubos del bloque de calentamiento y dejar que se equilibren a temperatura ambiente durante tres minutos, transfiera 400 microlitros de la muestra al tubo de separación de fases previamente centrifugado. A continuación, agregue 400 microlitros de solución de alcohol isoamílico de cloroformo de fenol y vórtice durante cinco segundos. Centrifugar el tubo a 16, 000 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Luego agregue 400 microlitros de cloroformo y vórtice durante cinco segundos. Centrifugar el tubo durante otros cinco minutos y transferir 400 microlitros de la fase superior a un nuevo tubo de 1,5 mililitros que contiene 24 microlitros de cloruro de sodio molar y 0,75 microlitros de glucógeno. Luego vórtice brevemente el tubo.
Agregue 1, 055 microlitros de etanol al 100%. Luego vortex completamente e incubar la muestra a menos 80 grados centígrados durante una hora o a menos 20 grados centígrados durante la noche. Una vez completada la incubación, centrifugar la muestra a 16, 000 G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados y retirar con cuidado el sobrenadante sin dislocar el pellet.
Agregue 500 microlitros de etanol frío al 70% e incline el tubo suavemente para asegurarse de que el pellet esté lavado. Centrifugar el tubo a 16, 000 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Retire con cuidado todo el sobrenadante y deje que el pellet se seque a temperatura ambiente.
Alternativamente, incubar el tubo a 37 grados centígrados para un secado más rápido. Agregue 50 microlitros de solución Tris-EDTA y coloque el tubo en el bloque de calentamiento durante cinco a 10 minutos agitando a 300 RPM. Luego analice el ADN en un gel de agarosa al 1%.
Después de la desvinculación de la cromatina y la visualización del ADN en el gel de agarosa, el cizallamiento exitoso se puede reconocer por la presencia de fragmentos en el rango de 100 a 300 pares de bases. La cromatina se precipitó con éxito con trimetilación H3K4, acetilación H3K27 y anticuerpos de trimetilación H3 K27 y se analizó posteriormente mediante qPCR. El cromosoma uno de lectura abierta 43, la subunidad beta dos del proteasoma 20S y las regiones promotoras de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa que se transcriben activamente en el hígado mostraron enriquecimiento para la trimetilación de H3K4 y la acetilación de H3K27.
En comparación, homeobox C13, homeobox C12 y las regiones promotoras del factor de transcripción de mielina de ratón que están silenciadas en el hígado no se enriquecieron como se esperaba. La trimetilación H3 K27 muestra el comportamiento opuesto, confirmando así el éxito de la inmunoprecipitación de cromatina o ensayo ChIP. La cromatina se sometió con éxito a ChIP-Seq.
Después de la secuenciación, las cañas se alinearon a un índice previamente preparado y se separaron según la especie. La trimetilación de H3K4 y la deposición de acetilación de H3K27 en los sitios de inicio de la transcripción génica antagonizaron con la deposición de trimetilación de H3K27 como se esperaba. El grupo Hox C es conocido por ser transcripcionalmente inactivo tanto en hígados de ratón como humanos.
El perfil de la trimetilación de H3K4 y la acetilación de H3K27 muestra picos para estas dos modificaciones postraduccionales fuera del grupo, mientras que la intensidad de la señal de trimetilación de H3K27 tiende a aumentar dentro del grupo de genes. La extracción de cromatina de muestras de tejido congelado tiene una alta variabilidad intrínseca, dependiendo en gran medida de la finura de la suspensión celular y la temperatura durante la reticulación. Garantizar condiciones de laboratorio fijas ayuda a mantener la reproducibilidad del rango de tamaño del fragmento.
