La meta total de este procedimiento es supervisar vasospasm cerebral después de hemorragia subaracoidea en ratones in vivo. Esto se logra mediante la aplicación de ecografía dúplex codificada por colores de alta frecuencia bajo anestesia con isoflurano. Los datos de la proyección de imagen se procesan para determinar las velocidades del flujo de sangre en las arterias carótidas internas intra y extracraneales.
Una velocidad intracraneal acelerada del flujo de sangre indica vasospasm cerebral. En este estudio, realizamos medidas de las velocidades del flujo de sangre de arterias intracraneales y extracraneales en hembra, ratones de C57BL/6N envejecidos 11 a 12 semanas. Los ratones fueron sometidos a la inducción de SAH o a la cirugía simulada que se ha descrito en detalle en otra parte.
Para preparar el examen de ecografía, encienda la máquina de ultrasonido e ingrese al animal ID.Warm la placa de calentamiento del sistema de ultrasonido a 37 grados Celsius. Asegúrese de que la sonda de temperatura rectal esté lista para su uso. Use un baño de agua tibia para calentar el gel de ultrasonido a 37 grados Celsius.
Preparar la crema de depilación, crema de contacto para los electrodos y ungüento para los ojos. Asegúrese de que el transductor esté montado correctamente en el brazo mecánico y asegúrese de que la cámara de inducción de la anestesia esté enjuagado con 4% de isoflurano y 40% de oxígeno. Induzca la anestesia poniendo el ratón en la cámara durante un minuto.
Proteja los ojos con ungüento. Continúe solo después de que se haya alcanzado una anestesia suficientemente profunda. Mantener la anestesia con 1,5% de isoflurano y 40% de oxígeno utilizando una máscara de anestesia durante todo el procedimiento.
En el primer paso, las velocidades del flujo de sangre de las arterias carótidas internas intracraneales se determinan con sonografía a dos caras de alta frecuencia transcranial. Coloque el ratón en posición decúbito prono en la placa de calentamiento del sistema de ultrasonido para mantener una temperatura corporal de 37 grados Centígrados. Aplique ungüento para los ojos en ambos lados.
Antes del primer examen acortar el pelaje en el occipucio con una afeitadora eléctrica. A continuación, retire el vello restante químicamente con crema de depilación. Use un hisopo de algodón para untar y frote la crema durante dos minutos hasta que el cabello comience a caerse.
Después de dos minutos adicionales retire la crema y el cabello con una espátula y desinfecte la piel con un antiséptico alcohólico para la piel. Cubra las cuatro extremidades del animal con pasta conductora y fijarlas con cinta adhesiva en los electrodos de ECG incrustados en el tablero. Coloque el lubricante en una sonda de temperatura rectal e insértela cuidadosamente para monitorear la temperatura corporal, usando una lámpara de calentamiento adicional si es necesario.
Compruebe, si los parámetros fisiológicos, ECG y la señal de respiración se muestran correctamente en la pantalla del sistema de ultrasonido. Si es necesario, el nivel de anestesia se puede ajustar para obtener la frecuencia cardíaca objetivo de 4 a 500 latidos por minuto. Recubrirlo con gel de ultrasonido.
Utilice un transductor de matriz lineal y una velocidad de fotogramas superior a 200 fotogramas por segundo para adquirir imágenes de ultrasonido y montarlo en el brazo mecánico. Coloque el transductor en el occipucio inclinado hacia atrás 30 grados. Utilice el modo B y el modo CW-Doppler para visualizar la arteria carótida interna intracraneal derecha y mueva el transductor con la unidad de control hacia adelante y hacia atrás hasta que encontremos el flujo máximo de las arterias.
Para recopilar información anatómica, utilice el modo B tradicional y el modo CW-Doppler y comience la adquisición haciendo clic en el botón adquirir. Para registrar información sobre las características de flujo de los vasos intracraneales, haga clic en el botón doppler de onda de pulso, coloque un volumen de muestra en el centro del recipiente y adquiera un bucle de cine de más de tres segundos. Proceda idénticamente con el lado izquierdo.
En el paso siguiente las velocidades del flujo de sangre de las arterias carótidas internas extracraneales se determinan con sonografía a dos caras de alta frecuencia. Coloque el ratón en decúbito supino en la placa de calentamiento del sistema de ultrasonido para mantener una temperatura corporal de 37 grados Centígrados. Antes del primer examen retire el vello de la parte frontal del cuello con una afeitadora eléctrica.
Luego elimine el vello restante químicamente usando crema de depilación como se describió anteriormente. Cubra las cuatro extremidades del animal con pasta conductora y fijarlas con cinta adhesiva en los electrodos de ECG incrustados en el tablero. Coloque lubricante en una sonda de temperatura rectal e insértela cuidadosamente para controlar la temperatura corporal.
Uso de lámpara de calentamiento adicional si es necesario. Compruebe de nuevo la visualización correcta de los parámetros fisiológicos en la pantalla. Cubra la parte frontal del cuello con gel de ultrasonido calentado a 37 grados Centígrados.
Coloque el transductor paralelo al animal y ajuste la posición para obtener imágenes longitudinales de la arteria carótida derecha. Utilice el modo CW-Doppler en modo B para visualizar la arteria carótida derecha. La imagen debe contener la arteria carótida común derecha, la arteria carótida interna derecha y la arteria carótida externa derecha.
Para recopilar información anatómica, utilice el modo B tradicional y el modo CW-Doppler y comience la adquisición haciendo clic en el botón adquirir. Para registrar la información sobre las características de flujo de la arteria carótida extracraneal, haga clic en el botón doppler de onda de pulso, coloque el volumen de la muestra en el centro del centro de la arteria carótida común, la arteria carótida interna y la arteria carótida externa y adquiera un bucle cine de más de tres segundos. Proceda idénticamente con el lado izquierdo.
Termine la anestesia y retire al animal de la placa de calentamiento y colóquelo en una jaula, colocado en una incubadora calentada a 36 grados Centígrados durante una hora para prevenir la hipotermia y verificar la recuperación completa. El siguiente paso es procesar los datos de ecografía. Uso de estación de trabajo externa para el post-procesamiento de los datos de ultrasonido de alta frecuencia.
Exporte las imágenes en modo B, modo CW-Doppler y modo PW-Doppler y bucles de cine al software Vevo LAB. Abra el estudio de ultrasonido exportado. Seleccione un animal y abra el bucle cine PW-Doppler de la arteria carótida intracraneal.
En este protocolo típicamente se registran de siete a ocho latidos del corazón en las curvas de velocidad de flujo correspondientes. Pausa el bucle de cine y haz clic en el botón de medición. Elija el paquete vascular y haga clic en RICA PSV para medir la presión sistólica máxima de la arteria carótida intracraneal derecha.
Ahora haga clic a la izquierda en el pico de una curva de velocidad y tire de la línea recta a la línea cero. Determine la medición con un clic con el botón derecho del ratón. Ahora elija RICA EDV para medir la velocidad diastólica final.
Haga clic a la izquierda en la erupción mínima de la curva de velocidad al final de la diástole. Tire de la línea recta a la línea cero y determinar la medición mediante un clic con el botón derecho del ratón. Elija RICA VTI para medir la integral de tiempo de velocidad.
Haga clic a la izquierda al principio de una curva de velocidad y siga la curva con un ratón hasta el final de la meseta diastólica. Y luego haga clic a la derecha de nuevo para determinar la medición. Exporte los datos de las arterias carótidas internas intracerebrales utilizando el botón de informe.
Pulse exportar y guarde los datos como un archivo de informe VSI. Utilice el mismo enfoque para medir psv, EDV y VTI de las arterias carótidas internas extracraneales derechas y exportar los datos en consecuencia. Proceda idénticamente con el lado izquierdo y utilice LICA PSV, EDV y VTI.
En cinco ratones y tres cuyo SAH fue inducido mientras que dos obtienen cirugía del impostor las velocidades del flujo de sangre de la arteria interna intracraneal y de la arteria carótida interna extracraneal fueron determinadas un día antes de cirugía y uno, tres y siete días después de la cirugía. Antes de cirugía, las velocidades adicionales e intracraneales del flujo de sangre así como el ratio de flujo de sangre intra y extracraneal eran similares entre el SAH y los animales del impostor. En el primer día después de la inducción de SAH no había cambios importantes en velocidades intra o extracraneales del flujo de sangre o los ratios entre el flujo de sangre intra y extracraneal.
El los días tres y siete las velocidades intracraneales del flujo de sangre de la arteria carótida interna aumentaron marcado y dos de los animales de SAH que indicaban el vasospasm cerebral después de SAH. Pues seguía habiendo las velocidades extracraneales del flujo de sangre casi sin cambiar, los ratios de velocidades intra y extracraneales del flujo de sangre también aumentaron perceptiblemente el el día siete en los animales de SAH que indicaban el vasospasm cerebral. En conclusión la sonografía a dos caras transcranial color-codificada de alta frecuencia se puede utilizar para realizar in vivo medidas de las velocidades del flujo de sangre intracraneal en ratones.
Similar a la situación en pacientes humanos las velocidades intracraneales del flujo de sangre aceleran en ratones después de SAH que indica vasospasm. El método ultra sonográfico mostrado aquí es rápido y de poca invasividad. Permite estudios longitudinales del vasoespasmo en modelos murinos de SAH.
