Esta técnica utiliza instrumentos que se encuentran comúnmente en la mayoría de los entornos de laboratorio y permite el análisis de varias muestras simultáneamente. Este método puede proporcionar información clave sobre cómo se regulan las enzimas del metabolismo de los lípidos en un contexto celular y en diferentes antecedentes genéticos. Inocular una colonia de una placa de cultivo de levadura en 20 mililitros de medios SC que contengan 2% de dextrosa e incubar a 30 grados Celsius durante la noche con agitación a 200 rpm.
Al día siguiente, diluya el cultivo en 50 mililitros de medios frescos a un OD final de 0.2 y cultive durante 24 horas hasta que se alcance la fase estacionaria. Prepare dos alícuotas de 20 mililitros de tampón de enfriamiento para cada muestra y guárdelas a menos 80 grados centígrados. Simultáneamente, prepare medios de radiomarcado agregando sal de sodio de ácido acético a los medios SC libres de dextrosa a una concentración final de 10 microcurie por mililitro.
Recoger las células centrifugando a 4, 100 x g durante 10 minutos. Retire el sobrenadante y lave el pellet celular una vez con 20 mililitros de medios SC libres de dextrosa. Recoja las células de nuevo centrifugando a 4, 100 x g durante cinco minutos y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros etiquetado utilizando medios libres de diestro.
Centrifugar las células durante otros dos minutos. Resuspend las células en 500 microlitros de medios SC libres de dextrosa y comenzar el período de radioetiquetado agregando rápidamente 500 microlitros de medios de radiomarcado a cada suspensión celular. Incubar los tubos en una incubadora giratoria a 30 grados centígrados durante 20 minutos.
Mientras tanto, preenfríe la centrífuga equipada para tubos cónicos de 50 mililitros a menos 10 grados centígrados y descongele una alícuota de 20 mililitros de tampón de enfriamiento. Una vez que el período de radioetiquetado haya terminado, use una pipeta para sumergir toda la muestra de un mililitro en un tampón de enfriamiento descongelado en hielo. Recoja el pellet celular girando en una centrífuga preenfriada a 5, 000 x g durante tres minutos y agregue 20 mililitros de tampón de enfriamiento en frío fresco.
Vórtice y agite las muestras para resuspendírlas completamente en el tampón de enfriamiento y centrifugar las muestras nuevamente para recolectar las células. Una vez que las células estén peletadas, retire completamente todo el tampón de enfriamiento de las muestras vertiendo el sobrenadante y eliminando el exceso con una pipeta. Guarde los tubos a menos 80 grados centígrados para su posterior procesamiento.
Pesar 0,3 gramos de perlas de vidrio lavado con ácido para cada muestra y almacenarlas en dos tubos de microcentrífuga de mililitros sobre hielo. Retire los gránulos de la celda del congelador de menos 80 grados y colóquelos sobre hielo. Luego, agregue 350 microlitros de metanol y 700 microlitros de cloroformo a cada muestra y resuspenda las células.
Transfiéralos a tubos de micro centrífuga que contengan perlas de vidrio prepesadas. Lise las células vórtice tres veces durante un minuto, con 30 segundos de incubación en hielo entre agitaciones. Vierta las células en un tubo centrífugo de vidrio de 15 mililitros y etiquete el tubo como tubo A.Lave el tubo de microcentrífuga con un mililitro de metanol, vórtice y vierta el metanol en el tubo A.Agregue dos mililitros de cloroformo seguidos de 400 microlitros de agua al tubo A para un volumen de muestra final de 4.45 mililitros.
Vórtice las muestras durante un minuto seguido de una centrifugación de cinco minutos a 1000 x g para separar claramente las fases acuosa y orgánica con restos celulares que yacen en la interfaz. Usando una pipeta de pasto de vidrio, recoja la fase orgánica en un nuevo tubo de centrífuga de vidrio etiquetado como B y agregue un mililitro de cloruro de potasio molar. Agregue un mililitro de metanol y dos mililitros de cloroformo al tubo A y repita los pasos de vórtice y centrifugación.
Vórtice y tubo centrífugo B para separar la fase acuosa y orgánica. Retire la capa acuosa superior y recoja toda la capa orgánica inferior en un vial de vidrio de cuatro mililitros. Evapore completamente el disolvente de los extractos de lípidos secándolo bajo gas inerte y precaliente un horno a 145 grados celsius para calentar la placa TLC.
Determine las cantidades relativas de radioetiquetas tomadas por las células antes de cargarlas en la placa TLC. Reconstituir los lípidos de la muestra en 40 a 50 microlitros de cloroformo y metanol mezclados en una proporción de uno a uno mediante vórtice durante cinco minutos. Prepare 101 mililitros del disolvente de fase móvil en un cilindro graduado de vidrio.
Luego, vierta el solvente en una cámara TLC de vidrio que contenga una almohadilla de saturación TLC de 20 por 20 y una tapa de ajuste hermética. Prepara una placa canalizada de gel de sílice 60G de 20 por 20 y marca una línea a 1,5 centímetros por encima de la parte inferior de la placa con un lápiz. Una vez que la placa se haya calentado lo suficiente y la almohadilla de saturación de TLC esté saturada de disolvente, retire la placa de TLC del horno y proceda inmediatamente a cargarla.
Usando una pipeta, ubíque cinco microlitros de muestra en el origen de cada carril ubicado a 1,5 centímetros por encima de la parte inferior de la placa TLC y repita la carga hasta que se hayan cargado de 20 a 40 microlitros de muestra en cada carril. Una vez que se hayan cargado el estándar y las muestras, coloque la placa en la cámara de desarrollo y espere hasta que el disolvente haya llegado a la parte superior de la placa. Cuando la placa esté completamente desarrollada, retírela de la cámara y déjala secar en la campana extractora de humos durante 20 minutos.
Después de secar la placa, cúbrala con una película de plástico y colóquela en un casete en desarrollo con una pantalla de autoradiografía. Retire la pantalla del casete en desarrollo y colóquela dentro de un reproductor de imágenes de fósforo. Rocíe la placa TLC con el reactivo de p-anisaldehído hasta que la sílice esté saturada, luego hornéelo en un horno de 145 grados durante cinco minutos o hasta que hayan aparecido bandas.
Para cuantificar las especies lipídicas, raspe el gel de sílice que contiene especies de lípidos individuales y transfiéralos a viales de centelleo de vidrio. Agregue seis mililitros de líquido de centelleo y vórtice vigorosamente hasta que la banda de sílice se haya reducido a trozos pequeños. Coloque la rejilla con los viales de centelleo en un contador de centelleo y cuente ajustando el tiempo de recuento a dos minutos por vial.
Las imágenes de fósforo permiten la visualización del autorradiograma de ácidos grasos libres de etiquetas, triacilglicerol, diacilglicerol, colesterol y escualano. Se demostró que las especies de lípidos purificados pueden separarse en este método y posteriormente visualizarse mediante la pulverización de la placa TLC con reactivo de p-anisaldehído. Las especies visualizadas incluyen todos los lípidos mencionados anteriormente, además de los ésteres estériles.
Al aplicar un período de persecución de 10 minutos en medios sin radioetiquetas después del pulso, se observó que en el grupo principal de escualano desapareció y el colesterol total se elevó. Del mismo modo, la aparición de diacilglicerol en el período de persecución se correlacionó con una disminución en la señal de ácidos grasos libres. Antes de realizar el protocolo completo, es importante determinar si las células tomarán la radioetiqueta de ácido acético en la condición de crecimiento y los antecedentes genéticos de interés.
