Presentamos un protocolo para producir un gran número de exosomas de grado GMP a partir de células madre mesenquimales del líquido sinovial utilizando nuestro biorreactor 3D. Estos exosomas podrían utilizarse en la investigación de la biología de exosomas y el tratamiento clínico de la artritis. Demostrando el procedimiento estará el Dr. Yujie Liang.
Comience a recolectar las células mesenquimales humanas, o MSC, centrifugando el líquido sinovial a 1, 500 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con 10 mililitros de PBS. Centrifugar las células resuspendidas a 1.500 veces G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius y desechar PBS antes de volver a suspender el pellet con 10 mililitros de medio de cultivo MSC humano a una densidad celular de cinco veces 10 a la cuarta células por mililitro y luego colocar la suspensión en un plato de 100 milímetros.
Incubar el plato a 37 grados centígrados en una atmósfera que contenga 5% de dióxido de carbono. Después de dos semanas, recolecte el sobrenadante de cultivo celular para identificar las células madre mesenquimales del líquido sinovial, o SF-MSC, utilizando citometría de flujo. Para hacerlo, digiera el pasaje de tercera generación tres de SF-MSC por centrifugación a 1.000 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Luego, deseche el sobrenadante antes de recoger la bolita celular. A continuación, agregue 400 microlitros del tampón de bloqueo al pellet celular a la concentración de cinco veces 10 al cuarto y deje que el pellet repose durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de 15 minutos, centrifugar la suspensión celular como se describió anteriormente, luego resuspender el pellet separado en 100 microlitros de 1X PBS.
Añadir un microlitro del anticuerpo fluorescente monoclonal a una relación de dilución de 1:100 por tubo como se describe en el manuscrito, y colocar el tubo para incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación, lave las células dos veces con 1X PBS y resuspenda las células en 100 microlitros de 1X PBS. Luego, detecte los fluoróforos en hasta 10, 000 células en un citómetro de flujo utilizando canales rojos y FIFC.
Para preparar los microportadores, hinche e hidrate en seco 0,75 gramos de los microportadores en 1X DPBS a la concentración de 50 miligramos por gramo durante al menos tres horas a temperatura ambiente. Luego, decantar el sobrenadante para lavar los microportadores en DPBS fresco durante cinco minutos. Después de reemplazar el medio con 1X DPBS fresco a 50 miligramos de los microportadores por gramo, esterilice los microportadores en autoclave a 121 grados centígrados durante 15 minutos a 15 libras por pulgada cuadrada.
Luego, deje que los microportadores esterilizados se asienten antes de decantar el sobrenadante. Enjuague los microportadores en el medio de cultivo a la concentración de 50 miligramos de los microportadores por gramo a temperatura ambiente. Cuando los microportadores estén asentados, deseche el sobrenadante.
Para preparar el biorreactor de perfusión, esterilice el biorreactor en autoclave como se describió anteriormente. Cuando haya terminado, cuente el número de SF-MSC para asignar 2.5 veces 10 al séptimo SF-MSC y microportadores al biorreactor perfundido con 250 mililitros del medio de cultivo MSC de grado GMP. Coloque el biorreactor en una incubadora con 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados a una velocidad de 15 rotaciones por minuto.
Cambiar el medio de cultivo cada seis días. Después de 14 días, recolecte los sobrenadantes y microportadores del cultivo celular para su posterior análisis. Centrifugar el sobrenadante de cultivo celular a 300 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y recoger el sobrenadante mientras desecha los restos celulares.
A cuatro grados centígrados, centrifugar secuencialmente el sobrenadante a 2, 000 veces G durante 10 minutos y luego a 10, 000 veces G durante 30 minutos para descartar las vesículas más grandes y recoger el pellet. Después de resuspender el pellet en 40 mililitros de PBS, centrifugar la suspensión celular a 120, 000 veces G durante 70 minutos a cuatro grados centígrados. Luego, resuspenda el pellet recolectado que contiene exosomas en 500 microlitros de PBS.
Diluir las muestras de exosomas recién aisladas con PBS estéril a la concentración de 10 a la séptima a 10 a la novena partículas por mililitro e inyectar 500 microlitros de la muestra para cada ejecución en el análisis de seguimiento de nanopartículas, o sistema NTA, a 30 microlitros por minuto y 24.4 a 24.5 grados centígrados. Configure manualmente el sistema de captura y análisis de acuerdo con el protocolo del fabricante. Visualice las partículas mediante la dispersión de la luz láser y capture su movimiento browniano en video digital.
A continuación, analice las cintas de video grabadas utilizando software, rastreando al menos 200 partículas individuales por ejecución. Para la Western blotting, agregue 300 microlitros del tampón de lisis y el cóctel de inhibidores de la proteasa a los exosomas con la mezcla pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Luego, deje reposar sobre hielo durante 20 minutos.
Después de la centrifugación de la mezcla a 9, 391 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, mida la concentración de proteína en el sobrenadante utilizando un kit de ensayo de proteínas. Después del ensayo, caliente la muestra con 100 microlitros de tampón de carga de proteína 4X a 100 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, cargue 15 microlitros de proteínas a una concentración de 10 miligramos por mililitro para que funcionen mediante electroforesis en gel a 120 voltios durante 70 minutos, y electrotransferencia a 100 voltios durante 60 minutos a cuatro grados centígrados.
Detectar los marcadores específicos no exosomales, como la calnexina y los biomarcadores exosomales como CD9, CD63 y CD81 mediante Western blot fluorescente. En el estudio, se utilizó citometría de flujo para identificar los marcadores de superficie de SF-MSCs. El análisis de citometría de flujo reveló que los SF-MSCs cultivados fueron negativos para CD34, CD45 y HLA-DR, y positivos para CD73, CD90 y CD105, cumpliendo con los criterios de identificación de MSCs.
Bajo microscopía invertida, se observó que los SF-MSC proliferan en microportadores. El SF-MSC proliferó en la cultura 3D más rápidamente a partir de seis días en comparación con la cultura 2D. Los exosomas de SF-MSCs de cultivo 2D y 3D se identificaron utilizando Western blot y se encontró que los exosomas expresaban CD63, CD9 y CD81 mientras eran negativos para calnexina.
El análisis de nanocitos demostró que el diámetro de los exosomas 2D y 3D era de aproximadamente 120 nanómetros. El análisis microscópico electrónico de transmisión reveló la morfología de los exosomas 2D y 3D, mostrando vesículas aproximadamente esferoidales. Utilizando el análisis NTA, se analizó la concentración de partículas de 30 a 160 nanómetros de tamaño.
Después del cultivo 3D, la concentración de partículas fue de 4.0 veces 10 a seis por mililitro. Sin embargo, después del cultivo 2D, la concentración de partículas del mismo tamaño fue de 2,5 veces 10 a seis por mililitro. Además, el cultivo 3D produjo más proteínas exosómicas que el cultivo 2D.
El análisis representativo muestra la internalización de exosomas marcados con Dil por condrocitos primarios. Los exosomas marcados con dil que ingresaron a los condrocitos primarios se pueden ver con un pico a las tres horas. El estudio de entrega in vitro demostró que los exosomas podrían administrar microARN-140 marcado con sulfocianina3 a los condrocitos.
El recubrimiento de las células, el inicio de la reacción en el biorreactor y el sobrenadante son los pasos más importantes en este protocolo. El cultivo 3D se usa comúnmente para el cultivo a gran escala de células adherentes. Otros métodos, como la flexión de espín, también se pueden utilizar para la producción a gran escala de exosomas.
Nuestro método mejora el rendimiento de los exosomas, lo que permite la aplicación preclínica basada en exosomas MSC.
