La recolección de un medio acondicionado enriquecido con exosomas a partir de células cultivadas en frascos de biorreactor y el aislamiento por la sacarosa amortiguador ultracentrifugación dan como resultado una preparación exosoma de alto rendimiento con proteínas contaminantes mínimas o vesículas no exosomales. El uso de un solo cojín de sacarosa preparado en óxido de deuterio elude la laboriosa preparación de un gradiente discontinuo de sacarosa y reduce la cantidad de sacarosa necesaria para lograr la densidad requerida. La entrega in vitro efectiva de siRNA encapsulada en exosomas preparados en este protocolo pone de relieve el potencial de este sistema como una terapia basada en interferencias de ARN de nueva generación para el cáncer de páncreas.
Para empezar, cultivo de células HEK-293 en medio normal, como se describe en el manuscrito. Expande las células en cuatro matraces T75 y crece hasta que alcancen el 90% de confluencia. Para preparar un matraz de biorreactor, añada de 50 a 100 mililitros de medio normal en el depósito medio del matraz del biorreactor para humedecer la membrana.
Recoger todas las células HEK-293 de los cuatro matraces T75, y resuspenderlos en 15 mililitros de medio exósoma-agotado en un tubo centrífugo. A continuación, utilice una jeringa de 20 mililitros conectada a una aguja de llenado contundente para agregar cuidadosamente esta suspensión celular al compartimiento celular del matraz del biorreactor. A continuación, llene el reservorio medio del matraz de biorreactor con el medio normal, hasta 500 mililitros, e incubarlo a 37 grados centígrados, 5% CO2 durante una semana.
Después de una semana de incubación, retire todo el medio del depósito medio del matraz del biorreactor vertiéndolo. Con una jeringa de 20 mililitros conectada a una aguja de llenado contundente, retire todo el medio del compartimiento de la celda. A continuación, añada de 50 a 100 mililitros de medio normal al depósito medio y 15 mililitros de medio fresco agotado por exosomas al compartimiento celular utilizando una jeringa de 20 mililitros conectada a una aguja de llenado contundente.
A continuación, llene el reservorio medio del matraz de biorreactor con un medio normal de hasta 500 mililitros. Incubar a 37 grados centígrados, 5% co2 durante otra semana. Para pre-limpiar el medio acondicionado recogido, centrifugarlo a 500 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y deseche el pellet. Después de repetir este paso de centrifugación con el sobrenadante recuperado, recuperar el sobrenadante de nuevo y desechar el pellet. Luego, centrifugar el sobrenadante recuperado a 2.000 veces g durante 15 minutos y cuatro grados centígrados.
Conservar el sobrenadante y desechar el pellet. Filtrar el sobrenadante una vez a través de un filtro de 22 micrómetros unido a una jeringa de 20 mililitros en un tubo de centrífuga fresca. Mientras tanto, para preparar una solución de sacarosa al 25% en óxido de deuterio, pesar con precisión 1,9 gramos de sacarosa en un tubo universal.
Luego, añadir óxido de deuterio hasta que el peso alcance 7.6 gramos. A continuación, llene un tubo ultracentrífugo con 22,5 mililitros de medio acondicionado pre-despejado. Coloque una pipeta de vidrio en el tubo.
Añadir tres mililitros de solución de sacarosa a través de la pipeta para que la solución forme una capa separada debajo del medio acondicionado. Coloque cuidadosamente el tubo que contiene solución de media/sacarosa condicionada en capas en el cubo de un rotor oscilante. Fije el cucharón en el rotor.
Coloque el rotor en la ultracentrífuga y gire a 100.000 veces g a cuatro grados centígrados durante 1,5 horas. Recoger dos mililitros de la capa de sacarosa del tubo, un mililitro a la vez utilizando una pipeta P1000, con su punta unida a una punta de 10 microlitros, y añadirlo a una botella ultracentrífaca que contiene 20 mililitros de PBS filtrados para el lavado. Coloque el tubo en un rotor de ángulo fijo y centrifugarlo a 100.000 veces g a cuatro grados centígrados durante 1,5 horas.
Utilice una pipeta serológica de 10 mililitros para retirar cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender el pellet con 400 microlitros de PBS filtrado. Antes de iniciar la electroporación, pre-enfríe la cubeta de electroporación sobre hielo durante 30 minutos.
Mezclar siete microgramos de exosomas con 33 microgramos de ARNr en el tubo de microcentrífuga. Añadir tampón de ácido cítrico para lograr el volumen de 150 microlitros. Agregue la mezcla exosoma-siRNA a la cubeta de electroporación con una pipeta de plástico y tapice la cubeta.
Coloque la cubeta en la orientación derecha en el soporte de la cubeta del electroporador y gire la rueda giratoria del electroporador 180 grados en el sentido de las agujas del reloj. Seleccione el programa deseado y pulse el botón Inicio para iniciar la electroporación. La pantalla indicará un pulso correcto.
A continuación, gire hacia atrás la rueda 180 grados en sentido contrario a las agujas del reloj, y retire la cubeta. Utilice una pipeta de plástico para extraer la muestra de la cubeta en un nuevo tubo de microcentrífuga. Mantenga el tubo sobre hielo o en una nevera antes de su posterior procesamiento, si no se utiliza inmediatamente.
Para iniciar la eliminación gratuita de siRNA, pase 3,5 mililitros de PBS filtrado a través de la columna de cromatografía de exclusión de tamaño dos veces para equilibrarlo. Luego, disuelva 150 microlitros de muestra electroporada en 350 microlitros de PBS filtrados, y transfirtelo a la columna SEC. Recoja la primera fracción de 500 microlitros eluida de la columna en un tubo de microfure y márquelo como F0. A continuación, agregue 500 microlitros de PBS filtrados a la columna.
Recoja la siguiente fracción y márquela como F1. Repita la adición de la PBS y la recolección de fracciones de elución hasta que se recojan un total de 10 fracciones de 500 microlitros, o hasta F9. Por último, para eliminar cualquier residuo de muestra, lave la columna con PBS filtrado al menos dos veces y, a continuación, continúe con los experimentos, como se describe en el manuscrito. Los análisis morfológicos mediante microscopía electrónica de transmisión mostraron que los exosomas HEK-293 eran estructuras esféricas ligeramente superiores a 100 nanómetros.
Este resultado está de acuerdo con el de la medición del análisis de seguimiento de nanopartículas, que también mostró la distribución del tamaño de los exosomas. Además, fueron positivos para los marcadores exosomales CD81, CD9 y CD63. El porcentaje de recuperación de exosomas purificados mediante cromatografía de exclusión de tamaño y el porcentaje de recuperación de siRNA se calcularon como se describe en el manuscrito.
La recuperación posterior a la purificación del exosoma fue del 75%Utilizando la curva estándar del ARNr, la eficiencia de encapsulación del siRNA en los exosomas se calculó como de aproximadamente 10 a 20%Análisis cualitativo de citometría de flujo de la absorción in vitro de exosomas cargados con Atto655-siRNA fluorescente mostró que las células PANC-1 tratadas con exosomas encapsulados con SIRNA tenían el mayor cambio en la señal de fluorescencia. Esto fue confirmado por el hallazgo de que las células PANC-1 tratadas con exosomas encapsulados por siRNA registraron un mayor porcentaje de población positiva para la señal Atto655 en comparación con la tratada con exosomas descargados y mezcla de siRNA. La absorción celular de siRNA también fue significativamente mayor en células PANC-1 tratadas con exosomas encapsulados con siRNA en comparación con la tratada con la mezcla exosoma-siRNA, confirmando que los exosomas encapsulados por siRNA fueron internalizados por las células PANC-1 y que efectivamente entregaron el siRNA intracelularmente.
Es importante pesar la sacarosa y el óxido de deuterio con mucha precisión al preparar la solución de sacarosa, y utilizar siempre la solución de sacarosa recién preparada para evitar la alteración de la densidad durante el almacenamiento. La microscopía confocal se puede llevar a cabo para validar aún más la internalización del siRNA encapsulado en los exosomas en las células y estudiar su tráfico intracelular después de la absorción celular. Este protocolo nos permite evaluar el derribo específico del gen del siRNA suministrado por el exosoma y sirve como una herramienta para la nueva validación de objetivos en la terapia contra el cáncer basada en interferencias de ARN.
