Nuestro protocolo facilita la formulación de hidrogeles de polímeros-nanopartículas para su uso como biomateriales. Esperamos que los investigadores desarrollen este material para aplicaciones traslacionales y para explorar cuestiones biológicas básicas. Los hidrogeles de PNP se inyectan fácilmente a través de agujas y catéteres de pequeño diámetro, pero se auto-curan rápidamente después de la inyección.
Esto permite la administración controlada no invasiva de fármacos y células en largas escalas de tiempo. Esta tecnología empuja los límites para la terapia localizada y el lanzamiento extendido de la droga, con implicaciones para las condiciones furiosas amplias del cáncer a la regeneración del tejido a la inmunización pasiva. Para sintetizar nanopartículas por nano precipitación, agregue 50 miligramos de polímero PEG-PLA a un vial de centelleo de vidrio de ocho mililitros y agregue un mililitro de acetonitrilo al vial.
Vórtice para disolverse completamente. A continuación, agregue 10 mililitros de agua ultra pura a un vial de centelleo de vidrio de 20 mililitros con una pequeña barra de agitación y coloque el vial en una placa de agitación configurada a 600 revoluciones por minuto. Utilice una pipeta de 200 microlitros para añadir un mililitro de la solución de disolvente polimérico gota a gota al vial de agua.
Las nanopartículas de la cáscara del núcleo se formarán a medida que la solución de disolvente polimérico se disperse rápidamente por toda el agua. Verifique el tamaño de partícula mediante dispersión de luz dinámica de acuerdo con los protocolos estándar. A continuación, transfiera la solución de nanopartículas a una unidad de filtro centrífuga para concentrar la solución en menos de 250 microlitros y resuspend las nanopartículas en un tampón apropiado.
Para preparar el hidrogel, agregue 333 miligramos de solución madre 6% HPMC-C12 a una jeringa de bloqueo Luer de un mililitro y agregue 500 microlitros de la solución madre de nanopartículas al 20% y 167 microlitros de PBS a un vial de ocho mililitros. Después de mezclar, use una aguja para llenar otra jeringa de bloqueo Luer de un mililitro con la solución diluida de nanopartículas y conecte las dos jeringas a un mezclador de codo. Mezcle las dos soluciones durante aproximadamente 60 ciclos hasta que se haya formado un material de hidrogel blanco opaco homogéneo.
Para medir las propiedades reológicas del hidrogel formulado, inyecte el volumen apropiado de hidrogel de acuerdo con el espacio de geometría seleccionado en el centro de una placa de reómetro dentada y utilice pruebas oscilatorias y de flujo para medir las propiedades mecánicas de la muestra. Para caracterizar la liberación de fármacos del hidrogel, primero, prepare un capilar de vidrio mediante el uso de epoxi para sellar un extremo de cada tubo. Cuando el epoxi se haya establecido, use una aguja hipodérmica de cuatro pulgadas de calibre 22 para inyectar de 100 a 200 microlitros de hidrogel en un mínimo de tres tubos por muestra, y agregue cuidadosamente de 200 a 300 microlitros de PBS en cada volumen de hidrogel.
En los puntos de tiempo apropiados, de acuerdo con la escala de tiempo prevista de liberación de la droga, use una aguja para eliminar cuidadosamente el PBS de cada capilar sin perturbar la superficie del hidrogel y agregue un volumen fresco de PBS. Al finalizar el estudio, analizar las alícuotas de PBS recogidas con un método adecuado para cuantificar la cantidad de fármaco liberado en cada momento. Para caracterizar la estabilidad térmica de la insulina encapsulada en gel, cargue tanto la insulina como la tioflavina T en el hidrogel como se ha demostrado y use una aguja calibre 21 para inyectar 200 microlitros de la carga y el hidrogel cargado por sonda en al menos tres pozos de una placa negra de 96 pocillos por muestra.
Luego selle la placa con un sello de placa adhesiva ópticamente transparente para evitar la evaporación e inserte la placa en un lector de placas equipado con control de temperatura, agitación y una programación de lectura cinética. Para evaluar la viabilidad de las células encapsuladas en hidrogel, utilice una aguja de calibre 21 para inyectar 150 microlitros de hidrogel que contengan la concentración adecuada de células en cada uno de los tres pocillos por muestra en una placa de 96 pocillos de fondo transparente y agregue 100 microlitros del medio celular apropiado en cada volumen de hidrogel. El primer día de cultivo, reemplace el sobrenadante en cada hidrogel en el punto de tiempo apropiado para cada grupo de muestra con 50 microlitros de dos milimomolares de calceína AM solución.
Después de una incubación de 30 minutos, imagen del centro de cada pozo por microscopía confocal. Para evaluar la capacidad de las células encapsuladas para asentarse en una jeringa antes de la inyección, diluir las células de interés a un uno por 10 a las seis células por mililitro en la concentración de PBS y teñir las células con 50 microlitros de dos milimolares Calcein AM durante 10 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, mezcle las células con 500 a 700 microlitros de hidrogel como se ha demostrado y use una aguja de calibre 21 para inyectar de 100 a 200 microlitros de hidrogel que contienen células en el fondo de al menos una cubeta por muestra.
A continuación, iría las cubetas tumbadas de lado en el escenario de un microscopio confocal inmediatamente después de la inyección y a las una y cuatro horas después de la siembra para observar si las células se han asentado en el hidrogel o si han permanecido suspendidas. El adelgazamiento de cizallamiento y las capacidades de autocuración del gel se pueden observar utilizando protocolos de barrido de flujo y cizallamiento escalonado, respectivamente. La caracterización de los módulos de almacenamiento y pérdida utilizando un experimento de barrido de frecuencia de cizalladura oscilatoria en el régimen viscoelástico lineal en rangos de frecuencia de 0,1 a 100 radianes por segundo revela las propiedades similares a los sólidos.
Por lo general, no debe haber un cruce de los módulos de almacenamiento y pérdida de cizallamiento observados a bajas frecuencias para formulaciones más rígidas, mientras que los eventos de cruce se pueden esperar para formulaciones de hidrogel más débiles. Variar el contenido de polímeros de los hidrogeles PNP puede tener un impacto directo en la difusión de la carga a través de la red de polímeros y la tasa de liberación de los materiales. Los hidrogeles PNP también pueden estabilizar la carga que es susceptible a la inestabilidad térmica, extendiendo considerablemente la vida útil de la carga y reduciendo la dependencia del almacenamiento y la distribución de la cadena de frío.
La inclusión de motivos de integrina puede ser útil para adaptar hidrogeles de PNP para terapias celulares. Las células encapsuladas se pueden etiquetar fluorescentemente para facilitar su visualización y cuantificación. Por ejemplo, las formulaciones que carecen de sitios de adhesión tendrán una baja viabilidad celular, ya que las células encapsuladas no proliferan en comparación con las células encapsuladas y las formulaciones con motivos de adhesión, como la RGD.
Todavía estamos explorando cómo los cambios en la formulación afectan las características reológicas y la malla dinámica de la matriz polimérica. También utilizamos FRAP para estudiar la difusión de moléculas dentro del hidrogel. Estos materiales se pueden utilizar para hacer nuevas preguntas biológicas sobre cómo la administración sostenida podría afectar la administración de fármacos, el desarrollo de vacunas o la inmunoterapia contra el cáncer.
