Las células madre musculares permanecen asociadas con su nicho endógeno y pueden manipularse fácilmente, por ejemplo, a través de la transfección de siRNA. Este método permite analizar las células madre musculares en cultivo en un entorno que se asemeja más a la situación in vivo que los modelos de cultivo 2D estándar al preservar el nicho. Comience cortando pipetas pasteur estériles con un bolígrafo de diamantes.
Para cada ratón, use una pipeta de gran diámetro con una abertura de aproximadamente 0,3 centímetros y una longitud de aproximadamente 10 a 12 centímetros y una segunda pipeta de vidrio con una pequeña abertura de aproximadamente 0,1 centímetros y una longitud de aproximadamente 22 centímetros. Alisar los bordes de ambas pipetas manteniendo las puntas de la pipeta en la llama de un quemador Bunsen durante cinco a 10 segundos con un movimiento suave. Inmediatamente antes de usar, cubra ambas pipetas con suero de caballo estéril llenando toda la pipeta con 2 mililitros de suero de caballo durante cinco minutos, luego inyecte el suero de caballo y deje que las pipetas se sequen durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Rocíe todo el equipo y las extremidades posteriores del ratón con etanol al 70%. Use tijeras curvas finas endurecidas y fórceps finos para eliminar la piel y exponer los músculos subyacentes. Retire la fascia circundante con las finas pinzas curvas sin dañar los músculos subyacentes.
Para eliminar el tibial anterior o TA, agarre el tendón DIStal de TA con fórceps y córtelo con tijeras finas. Mientras sostiene la TA en el tendón, tire de ella hacia la rodilla y corte el músculo cerca de la rodilla para exponer el músculo EDL. Levante el tendón distal de EDL con pinzas curvas y corte con tijeras finas de resorte Vannas.
Exponga el tendón EDL proximal tirando cuidadosamente del EDL hacia la rodilla. Luego corte el tendón proximal con tijeras. Incubar los músculos EDL en el tubo de reacción a 37 grados centígrados en un baño de agua circulante.
Detenga la digestión cuando los músculos se aflojen y las fibras de una sola milla sean visibles. Trabajar bajo un microscopio binocular estéril equipado con una placa calefactora enjuagó los músculos con un medio de aislamiento cálido utilizando la pipeta de gran diámetro. Disociar los músculos con la pipeta de gran diámetro hasta que el número deseado de miofiberes flote libremente en la solución.
Para lavar los escombros, use la pipeta de vidrio de pequeño orificio para transferir miofibras no contraídas al segundo pozo lleno de medio de aislamiento. Luego transfiera de 50 a 100 miofiberes no contraídas a un pozo de una placa de 24 pozos llena de medio de cultivo de miofiber. Incubar las miofiberes a 37 grados Centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 72 a 96 horas.
Transfectar las células madre musculares asociadas a miofiber cuatro horas después del aislamiento de myofiber. Combinar 25 microlitros de Opti-MEM con el volumen respectivo de siRNA con 25 microlitros Opti-MEM que contienen 1,5 microlitros de reactivo de transfección. Incubar la mezcla de reacción durante cinco minutos y agregarla a las células en la placa de 24 pocillos.
Luego incuba la placa a 37 grados centígrados para el respeto del tiempo. Aquí solo se demuestran los pasos críticos del protocolo de tinción inmunofluorescente. Con cuidado, deseche el medio de cultivo myofiber mientras deja alguna solución en el pozo.
Agregue 500 microlitros de paraformaldehído al 2% para fijar las miofibras con sus células madre musculares adyacentes. Incubar la placa durante cinco minutos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante con cuidado y lave las miofiberes tres veces con PBS.
Cubra la placa con papel de aluminio durante los pasos de incubación después de la incubación con anticuerpos secundarios. Use una pluma hidrofóbica para dibujar un círculo en un portaobjetos de vidrio microscópico. Luego transfiera las miofiberes en el menor volumen posible a la diapositiva y disperse.
Retire el líquido residual con la pipeta pasteur de pequeño diámetro o una pipeta de 200 microlitros. Utilice dos gotas de medio de montaje acuoso y cubra las miofiberes con un resbalón de cubierta. Luego permita que los portaobjetos se sequen y guárdelos a cuatro grados centígrados en la oscuridad, seguido de un análisis microscópico.
Este protocolo demuestra la derivación y el cultivo de miofibras individuales de los músculos murinos de EDL. La tinción inmunofluorescente para Pax7 se utilizó para identificar núcleos de células madre musculares. El área magnificada expone la miofibra con su célula madre muscular adyacente y demuestra la señal de inmunofluorescencia PAX7 en el núcleo de una célula madre muscular.
La progresión miogénica de las células madre musculares se puede analizar mediante la expresión de marcadores. La presencia de Pax7 y la ausencia de expresión de MyoD se asocia con células madre musculares inactivas de miofibras recién aisladas. La expresión de MyoD se puede observar en células madre musculares en proliferación.
Después de 72 horas, las células madre musculares forman grupos de progenies con diferentes estados miogénicos, que es paralelo a la expresión de diferentes marcadores miogénicos. Solo las células Pax7 son células madre autorrenovables. Las células doblemente positivas Pax7 y MyoD están proliferando.
Mientras que las células myo D solo son células diferenciadoras. La transfección de siRNA de células madre musculares mostró acumulación de siRNA citoplasmático de manera granular, lo que indica una absorción eficiente. La cuantificación de las células Pax7 positivas transfectadas por miofiber reveló que el número de células transfectadas aumentó hasta un 74% después de 30 horas sin ningún efecto adverso en el número de células madre musculares.
Al intentar este protocolo, es de suma importancia diseccionar cuidadosamente el EDL sin causar ningún daño. Además de la transfección por siRNA, el análisis de animales transgénicos o la incubación con proteínas recombinantes es posible para análisis funcionales adicionales de células madre musculares en sus miofibras adyacentes.
