Nos gustaría dar las gracias a Sarah Dick para proporcionar la lectura crítica y comentarios. MAR titular de la Cátedra de investigación de Canadá en Genética Molecular y es un becario internacional de investigación del Instituto Médico Howard Hughes. Este trabajo fue apoyado por becas a MAR de los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Médico Howard Hughes, los Institutos Canadienses de Investigación en Salud, la Asociación de la Distrofia Muscular y el Programa de Investigación de Canadá Presidencia.

Todos los experimentos fueron manejados de acuerdo a la Universidad de Ottawa regulaciones para cuidado de los animales y la manipulación. Consulte la Tabla 1 para una visión general del protocolo. 1. Antes de arrancar el aislamiento <ol><li> Prepare las siguientes soluciones: 0,2% de colagenasa tipo I en DMEM (medio de Dulbecco modificado de Eagle; alto de glucosa, L-glutamina con 110 mg / ml de piruvato de sodio). Durante dos músculos EDL preparar 2 ml de 0,2% Collagenease en DMEM. Filtrar la solución a través del filtro de 0,22 micras. 10 min antes del aislamiento, precalentamiento a 37 ° C en un baño de agua. Alícuotas adicionales de colagenasa sin diluir se puede congelar a -20 ° C para su uso posterior. Nota: utilizar DMEM con piruvato de sodio a lo largo de todo el procedimiento. Las fibras no sobreviven en piruvato de sodio libre de soporte. <ul><li> Medios de lavado (utilizar para llevar a cabo todos los lavados). Suplemento DMEM con 1% penicilina / estreptomicina. Filtrar a través de 0.22 Micras filtro antes de su uso. </li><li> Miofibra medios de cultivo. Suplemento DMEM con FBS al 20%, extracto de embrión de pollo al 1% y 1% de penicilina / estreptomicina. Filtrar a través de filtros de 0,22 micras antes de su uso. </li><li> Matrigel platos recubiertos. Para las fibras de la cultura por un largo período de tiempo, le recomendamos que utilice Matrigel como sustrato de recubrimiento. Para preparar placas revestidas con Matrigel, descongelar una alícuota de Matrigel en 4 ° C durante la noche. El día después, diluir Matrigel 1:10 en DMEM. Mantener Matrigel en 4 ° C en todo momento y evitar los cambios bruscos de temperatura ya que esto crea cristales microscópicos dentro de la solución resultante en Matrigel recubrimiento desigual. Coloque los platos a ser recubierto sobre hielo. Platos capa con volumen suficiente para cubrir la superficie. Dejar reposar durante 1 min. Retire completamente el Matrigel sobrante. Vamos platos seco a 37 ° C durante al menos 3 horas antes de su uso o durante la noche. </li></ul> Nota: alícuotas de Matrigel diluido se puede volver a utilizar varias veces para fines de recubrimiento si se almacena a 4 y deg; C. </li><li> Por último, asegúrese de limpiar la estación de microscopio de disección y herramientas con un 70% de etanol. </li><li> Durante dos aislamientos EDL (un ratón) preparar cinco placas Petri de plástico (60 * 15mm) de la siguiente manera: <ul><li> Cuatro platos para el aislamiento (1 para el músculo disociación, 3 para lavados de serie). Todos los platos deben estar recubiertos con suero de caballo (HS) para evitar que se adhiera a las miofibras de plástico. Para recubrir, pipeta de 3 ml de suero de caballo en cada plato, remolino para permitir incluso la capa, eliminar el suero de caballo y dejar que el plato seco durante al menos 30 min. Añadir 4 ml de DMEM a cada placa. Mantener los platos a 37 º C en un 5% de CO 2 incubadora antes de su uso. </li></ul> Nota: suero de caballo se puede volver a utilizar varias veces, si se mantiene estéril. Alternativamente, una solución de 10% en DMEM HS se puede usar para platos de la capa. Use platos recubiertos SA a lo largo de todo el protocolo y cuando miofibras sobre las condiciones de cultivo flotantes. <ul><li> Un plato se utilizará para miofibras de cultivo después del aislamiento. Alttamaños o formatos ernative plato puede ser utilizado para el cultivo final de las miofibras en función de las aplicaciones posteriores. Sin embargo, no recomendamos tamaños de plato de más de 60 * 15 mm. Miofibras puede ser mantenido en suspensión por no más de 96 h antes de la contracción se produce hiper. Para los tiempos de cultivo más largas, se recomienda utilizar Matrigel platos recubiertos o placas. </li></ul></li><li> Para el aislamiento de fibra de uno (2 EDL), prepare dos pipetas Pasteur estériles: una pipeta de gran diámetro para el manejo de los músculos y una pequeña pipeta de orificio para la manipulación miofibras. Utilice una pluma de diamante para cortar cada pipeta de vidrio a la longitud deseada y pulimento de calor para suavizar los bordes pipeta. Mediante el uso de la llama, la curva de la punta de la pipeta de pequeño diámetro. Esto le ayudará a manejar las fibras individuales. Llama a esterilizar. Cubra cada pipeta con HS antes de su uso. </li></ol> 2. Disección del músculo y digestión <ol><li> Para el propósito de estos experimentos, 8 semanas de edad SV129, Pax7 Créer Cklr; Rosa26TdTomato (Pax7Cre-TdTomato) y Myf5 Cre-; Rosa26YFP se utilizaron. </li><li> Pulverizar extremidades traseras con 70% de etanol. Pin del animal (boca arriba) a un tablero de apoyo para tener una mejor comprensión de la extremidad posterior durante el procedimiento. </li><li> Con la ayuda de tijeras, corte a través de toda la longitud de la extremidad y exponer el músculo subyacente. Retire la piel, así como cualquier pelo o la piel (Figura 1A). </li><li> Con una tijera fina, cortar la fascia delgada sin dañar los músculos subyacentes. Visualmente localizar la EDL. La EDL se encuentra en el compartimento anterior de la extremidad posterior, justo debajo del tibial anterior (TA) muscular. </li><li> Con la ayuda de dos pinzas, exponer los tendones distales. </li><li> Cortar los tendones distales (tanto de la TA y EDL) con afiladas tijeras Vannas Cohann-primavera. </li><li> Con la ayuda de fórceps mantener tanto TA y músculos EDL por sus tendones y delicadamente tirar de los músculos hacia arriba hacia el extremo proximal. En este punto usted debería ser capaz de ver con claridadel músculo EDL justo debajo del músculo TA. Ahora, separar el EDL desde el músculo TA tirando de los dos tendones en direcciones opuestas (Figura 1B). Evite estirar el músculo EDL al realizar esta operación ya que podría dañar las fibras musculares. </li><li> Exponer el tendón EDL. Para visualizar mejor el tendón proximal que puede ayudar en este punto para eliminar el músculo TA. También puede ayudar a cortar un poco de tejido conectivo que rodea la rodilla (fig. 1C). </li><li> Cortar el tendón proximal y retire con cuidado el EDL (Figura 1D). </li><li> Al mantener el músculo a través de sus tendones, la transferencia a 2 ml de solución de colagenasa previamente preparado. Incubar a 37 ° C en un baño de agua. Nota: para el aislamiento de fibra de éxito, es importante aislar el EDL de tendón a tendón para que la integridad de miofibras se mantiene. Pasos 2,3 a 2,9 se puede realizar bajo un microscopio de disección. Alternativamente, el uso de un magnidentificación externa de vidrio también puede ayudar a tener una mejor visión de los músculos. </li><li> Repita los pasos 2,3 a 2,9 por aislar a la EDL segundo. Transferir el EDL segundos en el mismo tubo. Para evitar la digestión irregular, el aislamiento de la EDL segundo debe ser completado no más de 5 minutos después de la primera. Nota 1: tiempo de incubación puede ser necesario ajustar en función de la actividad de colagenasa. De incubación más largo o más corto puede ser necesario, dependiendo del tamaño, edad y / o condición muscular (por ejemplo, músculos fibróticos necesitar más tiempo en la digestión). Nota 2: Si se examina el comportamiento de las células satélite en condiciones de reposo, durante el tiempo de agitación muscular digestión puede activar las células satélite 10. </li><li> Durante el tiempo de digestión, compruebe periódicamente el músculo para evitar el exceso de digestión. Detener la digestión cuando los músculos comienzan a relajarse y fibras musculares son visibles. Para detener la digestión, transferir cuidadosamente ambos músculos precalentado a una placa de Petri con 4 ml de DMEM (dissociatien el plato). Con la pipeta gran tamaño de diámetro para realizar esta operación. Nota: evite overdigestion músculo, ya que provoca, inevitablemente, en el aislamiento de las fibras musculares hiper contratados. </li></ol> 3. La disociación individual miofibras y Cultura <ol><li> Para liberar fibras musculares, use la pipeta de vidrio de gran diámetro para vaciar el músculo con el medio caliente hasta que las fibras naturales comienzan a ser puesto en libertad. No triturar el músculo ya que inevitablemente dará lugar a dañar las fibras. Realizar este y los siguientes pasos bajo un microscopio de disección. </li><li> Continuar liberando fibras musculares hasta que el número deseado. Si el plato se requiere a temperatura ambiente durante más de 10 min permitir una min 5 (mínimo) de la incubación a 37 ° C, 5% de CO 2 a re-equilibrar el medio. Nota: si el medio alcanza temperaturas inferiores fisiológica (37 º C) durante un tiempo prolongado miofibras morirán. </li><li> Usando el tamaño pequeño orificio pipeta, transfer vivir fibras musculares individuales para un nuevo plato precalentado (el primero de tres lavados consecutivos). Manejar cada miofibra individualmente en lugar de transferir mayor parte de las miofibras todos a la vez. Si es necesario, se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 10-15 min a re-equilibrar el medio. </li><li> Repita el paso 2 para 3,3 veces más o hasta que todas las fibras musculares muertas y los desechos son eliminados. Se recomienda por lo menos tres lavados consecutivos para una correcta limpieza. Nota: miofibras muertos aparecerán como corto e hiper contratado bajo la luz del microscopio. </li><li> Incubar las miofibras individuales a 37 ° C, 5% de CO 2 en el plato último lavado (DMEM solo) durante al menos un hora antes de cambiar a medio de cultivo. Esto permite miofibras para adaptarse a las condiciones in vitro en ausencia de suero. Se encontró que la cultura inmediata de miofibras en medio sin suero rico aumenta contracción de la fibra. </li><li> Después de una hora, traslado miofibras a un plato precalentado nueva o para el formato de cultivo apropiadodependiendo de la aplicación de aguas abajo. Fibras de cultivo en medio de suero alto para permitir la activación de células satélite. Alternativamente, diferentes concentraciones de suero o extracto de embrión de pollo también se puede utilizar. Cambio de medio cada dos días. </li></ol> 4. Aplicaciones posteriores <ol><li> La inmunotinción. Miofibras en vivo se pueden fijar y teñir en cualquier punto de tiempo durante el aislamiento. La inmunofluorescencia se puede realizar en miofibras tanto flotantes como adjunto sustrato. Si la tinción miofibras flotantes, utilizar una pipeta de vidrio de pequeño diámetro para transferir miofibras de una solución a otra. Alternativamente, es posible mantener las miofibras en el mismo pozo a lo largo de todo el procedimiento y añadir / quitar las soluciones utilizando una pipeta de vidrio. Evitar la aspiración estándar ya que esto resultará en la eliminación de las miofibras así. En pocas palabras, eliminar completamente el medio de cultivo; miofibras fijos en paraformaldehído al 4% precalentado (PFA) durante 5 min. Ampliamente lavar en PBS varias veces. Incubamiofibras TE en 1% de glicina en PBS o en otras soluciones de temple estándar para minimizar las manchas PFA fondo. Si es necesario, permeabilizar las miofibras con 0,1% Triton X-100 en PBS durante 10 min seguido de un lavado de 5 min en PBS. Incubar las fibras en solución de bloqueo (10% de suero de caballo, 0,1% de Triton X-100, 1% NaN) durante 1 hora a temperatura ambiente o preferiblemente durante la noche a 4 ° C. Soluciones alternativas de bloqueo pueden ser utilizados, dependiendo del anticuerpo de interés. Lavar una vez en PBS durante 5 min. Incubar con el anticuerpo apropiado primario diluido en solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. Lavar las fibras 3 veces en 5 min por lavado en PBS para eliminar cualquier anticuerpo no unido. Se incuba con el anticuerpo secundario apropiado durante 45 min a 1 hora a temperatura ambiente. Lavar 3 veces en 5 min por lavado en PBS. Contrateñir núcleos con 1 mg / ml DAPI. Si la tinción fibras flotantes, transferir cada fibra a un portaobjetos de vidrio para microscopio adecuado. Eliminar cualquier exceso de PBS o medio. Aplicar montaje medium y luego añadir el cubreobjetos. Proceder a visualizar miofibras bajo un microscopio de fluorescencia. Ver Figura 4 para inmunofluorescencia representante en miofibras EDL. Procedimientos alternativos para la tinción de fuertes fijadores se describen en Verma, M. et al. 11 y Wosniak, AC et al. 12. </li><li> Oligonucleótido o transfección transitoria del plásmido. Miofibras en directo pueden ser transfectadas con siRNA plásmido o para el gen específico / s de interés. Cuando se utiliza siRNA, transfección doble se recomienda para gen desmontables eficiente. Se sugiere realizar la primera transfección después de las 8 horas de la aislamiento. Seis horas después de la transfección, reemplazar con medio fresco. Para la transfección siRNA, sugerimos de partida mediante el uso de una concentración final de 50 nM. Knockdown de la expresión génica pueden ser analizados por extracción de RNA o preferiblemente mediante inmunotinción. </li><li> La infección viral. Infección de las miofibras en vivo es posible, aunque la incidencia de la célulamuerte es mayor que la transfección con oligo y la eficacia de la infección puede ser variable dependiendo de las condiciones musculares y la edad. Por ejemplo, intactos miofibras musculares adultas no son particularmente sensibles a la infección viral debido a la presencia de la lámina basal que se ha demostrado que proporcionan una barrera protectora contra la infección de acogida 13, 14. Vectores lentivirales se prefieren sobre los vectores retrovirales, ya que pueden infectar células quiescentes (no mitótico). Para la infección viral, es aconsejable que las fibras de cultivo sobre un plato o placa recubierta de Matrigel y dejar miofibras ajustarse a las condiciones de medios para el primero 24 hr. </li><li> Vivo Imaging. Formación de imágenes en vivo de las miofibras es particularmente mucho tiempo y requiere un microscopio equipado con una 37 ° C, 5% de CO 2 cámara. Es útil para evaluar el comportamiento de las células satélite individuales. El trabajo realizado con esta técnica ha sido fundamental para el descubrimiento de la heterogeneidad de las células satélite y estudiar su comporvior en fibras (15 y 16). </li></ol>

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No hay intereses en conflicto.

El aislamiento y cultivo de fibras musculares individuales de los músculos intactos proporciona un excelente modelo in vitro para estudiar el proceso de regeneración muscular. Una característica única de este sistema es la preservación de las células satélite en su entorno fisiológico debajo de la lámina basal. Lo más importante, la técnica se puede utilizar para investigar el comportamiento de células estaminales musculares, tanto en reposo y estados activados. En los últimos 20 años, el sistema de cultivo miofibra ha proporcionado una perspectiva interesante sobre la biología de la población de células satélite con respecto a los determinantes intrínsecos y extrínsecos. Por fibras individuales de cultivo, la heterogeneidad celular por satélite con respecto a las miofibras, tipo muscular o potencial regenerativo se ha abordado 15. Elaborar estudios utilizando imágenes en directo de las fibras individuales cultivados permitió la obtención de información en el patrón de migración de las células satélite 16. La adquisición de datos cuantitativos es unalso posible. Aunque mucho tiempo, proporciona información importante sobre la distribución y ocurrencia de eventos específicos (células madre relación asimétrica división, proliferación y diferenciación, etc.) Junto con las aplicaciones descritas anteriormente, la proteína o la extracción de ARN a partir de fibras individuales es también posible, aunque el aislamiento de la población pura de células satélite por FACS u otros medios puede proporcionar una mejor plataforma para investigar los cambios de expresión de proteína o gen a un nivel molecular. En nuestra experiencia, el paso más crítico para el aislamiento de fibra de éxito es el &quot;tendón tendón&quot; aislamiento (pasos 2,5 a 2,9 en el texto del protocolo). Esto garantiza que después de la digestión del músculo, las fibras se liberan de la EDL con un daño mínimo o no aumentando así su rendimiento en los pasos siguientes.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reactivo / Material </td></tr><tr><td> La colagenasa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C0130-1g </td><td> Prepare frescos todo el tiempo para obtener resultados óptimos. Alícuotas adicionales de colagenasa sin diluir se puede almacenar a -20 ° C. </td></tr><tr><td> DMEM alto en glucosa + NaPyr </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td> Además de Pen / Strep es necesario reducir al mínimo las contaminaciones del aire </td></tr><tr><td> Caracterizado suero bovino fetal </td><td> Hyclone </td><td> SH30396.03 </td><td> Lote # KUJ35152 </td></tr><tr><td> El suero de caballo </td><td> Hyclone </td><td> SH300.74.03 </td><td> Lote # AVJ82494 </td></tr><tr><td> Extracto de embrión de pollo </td><td> Accurate Chemical </td><td> CE-650-T, Lote B7035010 </td><td> Evite la congelación-descongelación ciclos. </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD </td><td></td><td> Tienda de alícuotas a -20 ° C. Evite la congelación-descongelación ciclos. Guarde alícuotas diluidas a 4 ° C. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipo </td></tr><tr><td> Cohann-Vannas Spring Scissor Blades-6mm Straight-Sharp </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 15000-02 </td><td></td></tr><tr><td> Extra fino Tijeras Iris-10.5cm </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Moria-Iris pinzas curvas </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11373-12 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetas Pasteur </td><td> VWR </td><td> 14672-380 </td><td> 14672-200 </td></tr><tr><td> Diamond Pen </td><td> VWR </td><td> 52865-005 </td><td></td></tr><tr><td> 60 * 15m m Petri Dish </td><td> VWR </td><td> 25384-092 </td><td></td></tr><tr><td> Acrodisc 0,22 micras Filtro </td&gt; <td> VWR </td><td> CA28-145-477 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de disección StemiV6 </td><td> Zeiss </td><td></td><td> Una fuente de luz adicional puede ser necesaria para tener una vista mejor enfoque </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle

La regeneración muscular en el adulto se lleva a cabo por las células madre residentes llamadas células satélite. Las células satélite se definen por su posición entre la lámina basal y el sarcolema de cada miofibras. El conocimiento actual de su comportamiento depende en gran medida el uso del protocolo de aislamiento miofibra sola. En 1985, Bischoff se describe un protocolo para aislar las fibras individuales en vivo desde el flexor digitorum brevis (FDB) de ratas adultas con el objetivo de crear un sistema in vitro en el que se conserva la asociación física entre la miofibra y sus células madre 1. En 1995, el protocolo Rosenblattmodified Bischoff de tal manera que las miofibras se recogió por separado y manipular por separado después de la digestión con colagenasa en lugar de quedar aislada mediante sedimentación por gravedad 2, 3. El Rosenblatt o protocolo Bischoff ha sido adaptado a los diferentes músculos, edad o condiciones 3-6. La técnica miofibra aislamiento individual es indispensableherramienta debido a sus ventajas únicas. En primer lugar, en el único protocolo de miofibras, células satélite se mantiene por debajo de la lámina basal. Esta es una característica única del protocolo como otras técnicas tales como la clasificación de células activadas por fluorescencia requieren química y tejido disociación mecánica 7. Aunque el sistema de cultivo miofibra no pueden sustituir a los estudios in vivo, sí ofrece una excelente plataforma para abordar importantes propiedades biológicas de las células madre musculares. Miofibras individuales pueden ser cultivadas en condiciones estándar o enchapado en condiciones flotantes. Las células satélite en miofibras flotantes están sometidas a prácticamente ninguna otra influencia que el medio ambiente miofibras. Rigidez sustrato y el revestimiento se ha demostrado que influyen en la capacidad de las células satélite &#39;para regenerar los músculos 8, 9 así ser capaz de controlar cada uno de estos factores de forma independiente permite la discriminación entre nicho-dependiente y respuestas independientes. Diferentes concentraciones de suero tienenTambién se ha demostrado que tienen un efecto sobre la transición de la inactividad de la activación. Para preservar el estado de quiescencia de sus células satélite asociadas, las fibras se deben mantener en un medio bajo en suero 1-3. Esto es particularmente útil cuando se estudian los genes implicados en el estado de quiescencia. En medio rico suero, las células satélite activar rápidamente, proliferar, migrar y diferenciarse, imitando así el proceso de regeneración in vivo 1-3. El sistema se puede utilizar para realizar una variedad de ensayos tales como el ensayo de inhibidores químicos; expresión ectópica de los genes de virus de entrega; gen oligonucleótido basado knock-down o imágenes en directo. En este artículo se describe el protocolo de vídeo se utiliza actualmente en nuestro laboratorio para aislar miofibras individuales del extensor digitorum longus (EDL) de ratones adultos (6-8 semanas).

Aquí se describe el aislamiento de miofibras individuales del músculo EDL de ratones adultos. Miofibras exitosos producir dependerá de varios factores, como la actividad de la colagenasa o afecciones musculares o de edad. Lo más importante, el aislamiento del músculo a partir de tendón a los resultados del tendón en miofibras largos, intactos de músculo EDL. Figura 1 muestra un paso a paso la representación gráfica de la &quot;tendón a tendón&quot; aislamiento. Una vez que el músculo está completamente digerido, las miofibras se liberan mediante la aplicación de una presión suave al músculo. Figura 2A muestra una imagen representativa de un experimento de aislamiento miofibras después del primer lavado. En este punto, el cultivo contiene una mezcla de haces de fibras musculares individuales que aparecen como estructuras tubulares largas y brillante, hiper contraído miofibras que son oscuras y corto y los residuos del proceso de digestión. Al final de al menos tres lavados consecutivos, sólo miofibras vivos individuales deben permanecer en el diSH para el cultivo o análisis de aguas abajo (Figura 2B). Figura 2C muestra una fibra larga, en vivo, en comparación con una fibra de hiper contraído (C &#39;). En el momento del aislamiento, las células satélite aparecen como protuberancias diminutas en la superficie de miofibras (Figura 3A). Si se mantiene en medio rico suero, las células satélite activar, proliferar, migrar y, finalmente, se funden en miotubos (B). Después de 15 días en cultivo, todos los miotubos expresar el reportero YFP Myf5 (C) lo que sugiere que la regeneración muscular en el adulto se lleva a cabo por las células que en algún momento durante su desarrollo había expresado el factor determinante miogénica Myf5. Todas las células satélite expresar el factor de transcripción asociado Pax7 casilla 17. La línea de ratón reportero Pax7Cre-TdTomato puede ser utilizado para rastrear las células satélite a través de la expresión de la señal fluorescente TdTomato (Figuras 3D y E). Figura 4 muestra un representante inmunidadesnofluorescence de doble Pax7 + / células satélite MyoD. Clásicamente doble Pax7 + / + MyoD células satélite son consideradas progenitoras musculares comprometidos proliferativas que, o bien completar el programa de diferenciación por abajo de la regulación Pax7 manteniendo al mismo tiempo la expresión de MyoD o regresar a la quietud por abajo de la regulación y el mantenimiento de Pax7 MyoD expresión 18 <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Aislamiento del músculo EDL de ratón miembro posterior. Un miembro posterior. De un ratón adulto 8 semanas de edad. Las flechas indican el distal (rodilla) y el tendón tendón proximal (pie). B. Posición anatómica del tibial anterior (TA) muscular y el extensor digitorum longus (EDL). C. Al mantener el EDL a través del tendón proximal, el músculo se tira hacia la rodilla para exponer el tendón distal. D. El tendón distal escortar y la EDL se libera. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Los resultados representativos de un experimento de aislamiento miofibra sola. Un cuadro. Campo brillante de un experimento de aislamiento de miofibras en la primera etapa de lavado. Flecha roja indica miofibras en vivo, flecha blanca indica hiper miofibras contratados y la flecha amarilla indica las células, o miofibras escombros ECM. B. Después de lavados consecutivos en DMEM, sólo miofibras permanecer vivos. C y C &#39;. Imagen representa un largo miofibra intacta vivo (C) y una hiper corto contraído miofibras (C &#39;). Bar 10 micras. Las fotografías fueron tomadas con un microscopio Zeiss Axio Observer Z1 equipado con AxioCam HR. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figur<html> e 3. Los resultados representativos de un experimento miofibra sola cultura. Un cuadro. Campo brillante de una miofibra sola, vivo con su célula satélite asociado (flecha) a la derecha después del aislamiento (Tiempo 0). B. Miofibras individuales se sembraron en Matrigel y se cultivaron en medio rico suero durante 15 días. Flecha blanca indica miotubos diferenciados en comparación con las células individuales (flecha amarilla) c. Miofibras individuales desde un Myf5Cre; RosaYFP ratón se cultivaron como en B. La flecha indica Myf5 miotubos derivados. D y E. Miofibras individuales desde Pax7Cre; TdTomato se aislaron y se fija inmediatamente después. Las flechas indican Pax7 célula positiva satélite en reposo, (E, rojo). Los núcleos se tiñeron con DAPI (D). Bar: 50 m. Las fotografías fueron tomadas con un microscopio Zeiss Axio Observer Z1 equipado con AxioCam HR. formas &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Ejemplo de tinción de inmunofluorescencia de células de satélite en las miofibras. Miofibras individuales se aislaron y cultivaron durante 72 horas en condiciones flotantes. Las células satélite en miofibras se tiñeron para el marcador específico de células satélite Pax7 (B, rojo) y el MyoD myogenic factor regulador (C, verde). Los núcleos se tiñeron con DAPI (A). Bares: 50 m. Las fotografías fueron tomadas con un microscopio Zeiss Axio Observer Z1 equipado con AxioCam HR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Disección del músculo (5 min cada músculo) </td><td><ul><li> Tendón al aislamiento tendón </li><li> Herramientas afiladas </li><li> Daño muscular mínima </li></ul></td></tr><tr><td> Digestión músculo (30-45 min) </td><td><ul><li> Temperaturasensible </li><li> Evite overdigestion </li></ul></td></tr><tr><td> Fibra de aislamiento </td><td><ul><li> Evitar el exceso de manipulación de fibras </li><li> Eliminar la suciedad con varios lavados </li></ul></td></tr><tr><td> Cultura de fibra (hasta 3-4 semanas) </td><td><ul><li> Formato: cualquier </li><li> Recubrimiento: suero de caballo, Matrigel </li><li> Medio: basal sérica alta o </li></ul></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Descripción general del protocolo de aislamiento de miofibras. El protocolo de aislamiento de miofibras consta de 4 pasos principales. Para cada paso, el tiempo aproximado y los principales puntos críticos se discuten. Para un análisis detallado de cada paso, consulte el texto del protocolo.

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Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Aislamiento y cultivo de fibras musculares es el estándar de oro<em&gt; In vitro</emSistema&gt; para estudiar la transición de las células satélite a través de quiescencia, la activación y la diferenciación. Es importante destacar que el sistema de miofibra sola cultura conserva la asociación celular miofibra / vástago, que es un componente esencial del nicho de células madre musculares.

Aislamiento y cultivo de fibras individuales y sus células satélite del músculo esquelético adulto

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

isolation-culture-individual-myofibers-their-satellite-cells-from

Research

JoVE Journal

Biology

62.1K vistas.  Ottawa Hospital Research Institute. Aislamiento y cultivo de fibras musculares es el estándar de oro In vitro para estudiar la transición de las células satélite a través de quiescencia, la activación y la diferenciación. Es importante destacar que el sistema de miofibra sola cultura conserva la asociación celular miofibra / vástago, que es un componente esencial del nicho de células madre musculares.

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Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adultas y embrionarias del músculo esquelético Cultura Microexplant y aislamiento de células madre de músculo esquelético

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Investigación

Biología

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Aislamiento mitocondrial del músculo esquelético

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Aislamiento y cultivo de células madre adultas epiteliales de la piel humana

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Análisis de embriones y larvas de pez cebra esqueléticas miofibras de Preparativos disociadas

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Aislamiento, cultivo y trasplante de células musculares satélite

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Aislamiento de Vaso sanguíneo derivado Multipotentes Precursores de músculo esquelético humano

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Aislamiento y cultivo de células madre epiteliales dental del adulto Ratón Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

ADN electroporación, aislamiento e Imagen de miofibras

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Aislamiento y cultivo de queratinocitos de ratón primario de piel de ratón neonatal y adulto

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

Aislamiento y caracterización de exosomas de fibroblastos del músculo esquelético

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...