Le cellule staminali muscolari rimangono associate alla loro nicchia endogena e possono essere manipolate facilmente, ad esempio, attraverso la trasfezione di siRNA. Questo metodo consente di analizzare le cellule staminali muscolari in coltura in un ambiente che assomiglia più da vicino alla situazione in vivo rispetto ai modelli di coltura 2D standard preservando la nicchia. Inizia tagliando pipette pasteur sterili con una penna diamantata.
Per ogni mouse, utilizzare una pipetta di grande diametro con un'apertura di circa 0,3 centimetri e una lunghezza di circa 10-12 centimetri e una seconda pipetta di vetro con una piccola apertura di circa 0,1 centimetri e una lunghezza di circa 22 centimetri. Levigatura dei bordi di entrambe le pipette tenendo le punte della pipetta nella fiamma di un bruciatore Bunsen per cinque o 10 secondi con un movimento delicato. Immediatamente prima dell'uso, rivestire entrambe le pipette con siero di cavallo sterile riempiendo l'intera pipetta con 2 millilitri di siero di cavallo per cinque minuti, quindi iniettando il siero di cavallo e lasciando asciugare le pipette per cinque minuti a temperatura ambiente.
Spruzzare tutte le attrezzature e gli arti posteriori del mouse con il 70% di etanolo. Utilizzare forbici curve sottili indurite e pinze sottili per rimuovere la pelle ed esporre i muscoli sottostanti. Rimuovere la fascia circostante con la pinza curva fine senza danneggiare i muscoli sottostanti.
Per rimuovere il tibiale anteriore o TA, afferrare il tendine TA distale con una pinza e tagliarlo con forbici fini. Mentre tieni il TA al tendine, tiralo verso il ginocchio e taglia il muscolo vicino al ginocchio per esporre il muscolo EDL. Sollevare il tendine EDL distale con pinze curve e tagliare con forbici a molla Vannas fini.
Esporre il tendine EDL prossimale tirando con cura l'EDL verso il ginocchio. Quindi tagliare il tendine prossimale con le forbici. Incubare i muscoli EDL nel tubo di reazione a 37 gradi Celsius in un bagno d'acqua circolante.
Fermare la digestione quando i muscoli si allentano e le fibre di un solo miglio sono visibili. Lavorando sotto un microscopio binoculare sterile dotato di una piastra riscaldante lavava i muscoli con un mezzo di isolamento caldo usando la pipetta di grande diametro. Dissociare i muscoli con la pipetta di grande diametro fino a quando il numero desiderato di miofibre fluttua liberamente nella soluzione.
Per lavare i detriti, utilizzare la pipetta di vetro a foro piccolo per trasferire le miofibre non contratte al secondo pozzo riempito con mezzo di isolamento. Quindi trasferire da 50 a 100 miofibre non contratte in un pozzo di una piastra da 24 pozzetti piena di terreno di coltura in miofibra. Incubare le miofibre a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 72-96 ore.
Trasfettare le cellule staminali muscolari associate alla miofibra quattro ore dopo l'isolamento della miofibra. Combinare 25 microlitri di Opti-MEM con il rispettivo volume di siRNA con 25 microlitri Opti-MEM contenenti 1,5 microlitri di reagente di trasfezione. Incubare la miscela di reazione per cinque minuti e aggiungerla alle cellule nella piastra a 24 pozzetti.
Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per il rispetto del tempo. Qui sono dimostrati solo i passaggi critici del protocollo di colorazione immunofluorescente. Con attenzione, scartare il terreno di coltura della miofibra lasciando qualche soluzione nel pozzo.
Aggiungere 500 microlitri di paraformaldeide al 2% per fissare le miofibre con le loro cellule staminali muscolari adiacenti. Incubare la piastra per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere accuratamente il surnatante e lavare le miofibre tre volte con PBS.
Coprire la piastra con carta stagnola durante le fasi di incubazione dopo l'incubazione con anticorpi secondari. Usa una penna idrofoba per disegnare un cerchio su un microscopico vetrino. Quindi trasferire le miofibre nel minor volume possibile sul vetrino e disperderle.
Rimuovere il liquido residuo con la pipetta pasteur di piccolo foro o una pipetta da 200 microlitri. Utilizzare due gocce di mezzo di montaggio acquoso e coprire le miofibre con uno slip di copertura. Quindi lasciare asciugare i vetrini e conservarli a quattro gradi Celsius al buio seguiti da analisi microscopiche.
Questo protocollo dimostra la derivazione e la coltura di singole miofibre dai muscoli EDL murini. La colorazione immunofluorescente per Pax7 è stata utilizzata per identificare i nuclei delle cellule staminali muscolari. L'area ingrandita espone la miofibra con la sua cellula staminale muscolare adiacente e dimostra il segnale di immunofluorescenza PAX7 nel nucleo di una cellula staminale muscolare.
La progressione miogenica delle cellule staminali muscolari può essere analizzata mediante espressione di marcatori. La presenza di Pax7 e l'assenza di espressione di MyoD sono associate a cellule staminali muscolari quiescenti di miofibre appena isolate. L'espressione di MyoD può essere osservata nelle cellule staminali muscolari proliferanti.
Dopo 72 ore, le cellule staminali muscolari formano gruppi di progenie con diversi stati miogenici, che è parallelo all'espressione di diversi marcatori miogenici. Solo le cellule Pax7 sono cellule staminali auto-rinnovanti. Le cellule doppie positive Pax7 e MyoD stanno proliferando.
Mentre myo D solo le cellule sono cellule differenzianti. La trasfezione di siRNA delle cellule staminali muscolari ha mostrato un accumulo di siRNA citoplasmatico in modo granulare che indica un assorbimento efficiente. La quantificazione delle cellule pax7 positive trasfettate per miofibra ha rivelato che il numero di cellule trasfettate è aumentato fino al 74% dopo 30 ore senza effetti negativi sul numero di cellule staminali muscolari.
Quando si tenta questo protocollo, è della massima importanza sezionare attentamente l'EDL senza causare alcun danno. Oltre alla trasfezione di siRNA, è possibile l'analisi di animali transgenici o l'incubazione con proteine ricombinanti per ulteriori analisi funzionali delle cellule staminali muscolari sulle loro miofibre adiacenti.
