Les cellules souches musculaires restent associées à leur niche endogène et peuvent être manipulées facilement, par exemple par transfection de siRNA. Cette méthode permet d’analyser des cellules souches musculaires en culture dans un cadre qui ressemble plus à la situation in vivo que les modèles de culture 2D standard en préservant la niche. Commencez par couper des pipettes pasteur stériles avec un stylo diamant.
Pour chaque souris, utilisez une pipette à gros alésage avec une ouverture d’environ 0,3 centimètre et une longueur d’environ 10 à 12 centimètres et une deuxième pipette en verre avec une petite ouverture d’environ 0,1 centimètre et une longueur d’environ 22 centimètres. Lisser les bords des deux pipettes en maintenant les pointes de la pipette dans la flamme d’un brûleur Bunsen pendant cinq à 10 secondes avec un mouvement doux. Immédiatement avant utilisation, enduisez les deux pipettes de sérum de cheval stérile en remplissant la pipette entière de 2 millilitres de sérum de cheval pendant cinq minutes, puis en injectant le sérum de cheval et en laissant les pipettes sécher pendant cinq minutes à température ambiante.
Vaporisez tout l’équipement et les membres postérieurs de la souris avec de l’éthanol à 70%. Utilisez des ciseaux incurvés fins durcis et des pinces fines pour enlever la peau et exposer les muscles sous-jacents. Retirez le fascia environnant avec la pince incurvée fine sans endommager les muscles sous-jacents.
Pour retirer le tibialis antérieur ou TA, saisissez le tendon TA distal avec une pince et coupez-le avec de fins ciseaux. Tout en maintenant le TA au tendon, tirez-le vers le genou et coupez le muscle près du genou pour exposer le muscle EDL. Soulevez le tendon distal EDL avec une pince incurvée et coupez avec de fins ciseaux à ressort Vannas.
Exposez le tendon proximal de l’EDL en tirant soigneusement l’EDL vers le genou. Ensuite, coupez le tendon proximal avec des ciseaux. Incuber les muscles EDL dans le tube de réaction à 37 degrés Celsius dans un bain-marie circulant.
Arrêtez la digestion lorsque les muscles se relâchent et que des fibres d’un seul kilomètre sont visibles. Travailler sous un microscope binoculaire stérile équipé d’une plaque chauffante rinçait les muscles avec un milieu d’isolation chaud à l’aide de la pipette à grand alésage. Dissocier les muscles avec la pipette à grand alésage jusqu’à ce que le nombre souhaité de myofibres flotte librement dans la solution.
Pour laver les débris, utilisez la pipette en verre de petit alésage pour transférer les myofibres non contractés vers le deuxième puits rempli de milieu isolant. Transférer ensuite 50 à 100 myofibres non contractés dans un puits d’une plaque de 24 puits remplie de milieu de culture de myofibres. Incuber les myofibres à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 72 à 96 heures.
Transfecter les cellules souches musculaires associées au myofiber quatre heures après l’isolement du myofiber. Combiner 25 microlitres d’Opti-MEM avec le volume respectif de siRNA avec 25 microlitres Opti-MEM contenant 1,5 microlitres de réactif de transfection. Incuber le mélange réactionnel pendant cinq minutes et l’ajouter aux cellules de la plaque de 24 puits.
Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius dans le respect du temps. Seules les étapes critiques du protocole de coloration immunofluorescente sont démontrées ici. Soigneusement, jetez le milieu de culture myofiber tout en laissant une solution dans le puits.
Ajouter 500 microlitres de 2% de paraformaldéhyde pour fixer les myofibers avec leurs cellules souches musculaires adjacentes. Incuber la plaque pendant cinq minutes à température ambiante. Retirez soigneusement le surnageant et lavez les myofibres trois fois avec du PBS.
Couvrir la plaque avec du papier d’aluminium pendant les étapes d’incubation après l’incubation avec des anticorps secondaires. Utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner un cercle sur une lame de verre microscopique. Transférez ensuite les myofibres dans le plus petit volume possible sur la lame et dispersez-les.
Retirez le liquide résiduel avec la pipette pasteure à petit alésage ou une pipette de 200 microlitres. Utilisez deux gouttes de support de montage aqueux et couvrez les myofibres avec un couvercle. Laissez ensuite sécher les lames et stockez-les à quatre degrés Celsius dans l’obscurité, suivi d’une analyse microscopique.
Ce protocole démontre la dérivation et la culture de myofibres simples à partir de muscles murins EDL. La coloration immunofluorescente de Pax7 a été utilisée pour identifier les noyaux de cellules souches musculaires. La zone agrandie expose le myofiber avec sa cellule souche musculaire adjacente et démontre le signal d’immunofluorescence PAX7 dans le noyau d’une cellule souche musculaire.
La progression myogénique des cellules souches musculaires peut être analysée par l’expression de marqueurs. La présence de Pax7 et l’absence d’expression de MyoD sont associées à des cellules souches musculaires quiescentes de myofibres fraîchement isolés. L’expression de myoD peut être observée dans les cellules souches musculaires proliférantes.
Après 72 heures, les cellules souches musculaires forment des grappes de progénitures avec différents états myogéniques, ce qui est mis en parallèle par l’expression de différents marqueurs myogéniques. Les cellules Pax7 seules sont des cellules souches auto-renouvelées. Les cellules Pax7 et MyoD double positives prolifèrent.
Alors que les cellules myo D seules sont des cellules différenciantes. La transfection de siRNA des cellules souches musculaires a montré une accumulation de siRNA cytoplasmique de manière granulaire indiquant une absorption efficace. La quantification des cellules Pax7 positives transfectées par myofiber a révélé que le nombre de cellules transfectées augmentait jusqu’à 74% après 30 heures sans effet indésirable sur le nombre de cellules souches musculaires.
Lors de la tentative de ce protocole, il est de la plus haute importance de disséquer soigneusement l’EDL sans causer de dommages. En plus de la transfection de siRNA, l’analyse d’animaux transgéniques ou l’incubation avec des protéines recombinantes est possible pour d’autres analyses fonctionnelles de cellules souches musculaires sur leurs myofibres adjacents.
