筋肉幹細胞は内因性ニッチと関連付けられたままであり、例えばsiRNAトランスフェクションを介して容易に操作することができる。この方法により、ニッチを維持することにより、生体内の状況に近い環境で培養中の筋肉幹細胞を分析することが可能となる。まず、ダイヤモンドペンで滅菌パスツールピペットを切断します。
各マウスに対して、約0.3センチメートルの開口部と約10〜12センチメートルの長さの1つの大きなボアピペットと、約0.1センチメートルの小さな開口部と約22センチメートルの長さの2番目のガラスピペットを使用してください。穏やかな動きで5〜10秒間ブンゼンバーナーの炎の中にピペットの先端を保持することによって、両方のピペットのエッジを平滑化。使用直前に、ピペット全体に2ミリリットルの馬の血清を5分間充填し、馬の血清を注入し、ピペットを室温で5分間乾燥させることで、両方のピペットに無菌馬の血清をコーティングします。
70%エタノールでマウスのすべての機器と後肢をスプレーします。硬化した細かい湾曲したはさみと細かい鉗子を使用して皮膚を取り除き、下の筋肉を露出させます。下の筋肉を傷つけることなく、細かい湾曲した鉗子で周囲の筋膜を取り除きます。
脛表の前またはTAを取り除くために、鉗子で遠位TA腱をつかみ、細かいはさみでそれを切る。腱でTAを保持しながら、膝の方に引っ張り、EDL筋肉を露出させるために膝に近い筋肉を切断します。遠位EDL腱を曲がった鉗子で持ち上げ、細かいヴァンナススプリングハサミで切ります。
EDLを膝に向かって慎重に引っ張って、近位EDL腱を露出します。その後、近位腱をはさみで切ります。循環水浴で摂氏37度で反応管内のEDL筋肉をインキュベートします。
筋肉が緩み、単一のマイルの繊維が見えるとき、消化を停止します。加熱プレートを装備した無菌双眼鏡顕微鏡の下で作業すると、大きなボアピペットを使用して温かく分離媒体で筋肉を洗い流しました。所望の数のミオファイバーが溶液中に自由に浮かび上がるまで、大きなボアピペットで筋肉を解化します。
破片を洗浄するには、小さなボアガラスピペットを使用して、収縮していないミオファイバーを分離媒体で満たされた第2の井戸に移します。その後、50〜100個の非収縮ミオファイバーを、ミオファイバー培養培地で満たされた24ウェルプレートの1ウェルに移した。ミオファイバーを摂氏37度、炭酸ガス5%で72~96時間インキュベートします。
筋線維の分離の4時間後に筋幹細胞に関連する筋線維をトランスフェクトする。25マイクロリットルのトランスフェクション試薬を含む25マイクロリットルのオプティ-MEMと25マイクロリットルのsiRNAの各容積とオプティ-MEMを組み合わせます。反応ミックスを5分間インキュベートし、24ウェルプレートの細胞に加えます。
その後、時間の尊重のために摂氏37度でプレートをインキュベートします。ここでは、免疫蛍光染色プロトコルの重要なステップのみを示しています。慎重に、ウェル内にいくつかの溶液を残したまま、ミオファイバー培養培地を捨てます。
2%パラホルムアルデヒドの500マイクロリットルを加え、隣接する筋肉幹細胞で筋繊維を固定します。プレートを室温で5分間インキュベートします。上清を慎重に取り出し、PBSでミオファイバーを3回洗います。
二次抗体でインキュベーション後のインキュベーションステップ中に、プレートをtinfoilで覆います。疎水性ペンを使用して、顕微鏡的なガラススライドに円を描きます。その後、可能な限り最小の体積のミオファイバーをスライドに移し、それらを分散させます。
小さなボアパスツールピペットまたは200マイクロリットルピペットで残留液を取り除きます。水性取り付け媒体を2滴使用し、カバースリップでミオファイバーを覆います。その後、スライドを乾燥させ、暗闇の中で摂氏4度で保存し、顕微鏡分析を行います。
このプロトコルは、マウスEDL筋肉からの単一の筋繊維の導出および培養を示す。Pax7の免疫蛍光染色を用い、筋幹細胞の核を同定した。拡大領域は、隣接する筋幹細胞を有する筋繊維を露出し、筋肉幹細胞の核におけるPAX7免疫蛍光シグナルを示す。
筋幹細胞筋細胞は、マーカー発現により解析することができる。Pax7の存在とMyoD発現の欠如は、新たに単離された筋線維の静止筋幹細胞と関連している。筋幹細胞の増殖において筋質発現が観察される。
72時間後、筋肉幹細胞は異なる筋原性状態を有する子孫のクラスターを形成し、これは異なる筋原性マーカーの発現によって平行である。Pax7細胞だけが自己更新幹細胞である。Pax7およびMyoD二重陽性細胞が増殖している。
一方、筋Dのみの細胞は細胞を分化している。筋幹細胞のsiRNAトランスフェクションは、効率的な取り込みであることを示す顆粒様式で細胞質siRNAの蓄積を示した。筋繊維当たりトランスフェクトPax7陽性細胞の定量化により、トランスフェクト細胞数は30時間後に最大74%増加し、筋肉幹細胞数に悪影響を及ぼさないことが明らかになった。
このプロトコルを試みるとき、EDLを慎重に解剖することが最も重要です。siRNAトランスフェクションに加えて、トランスジェニック動物の分析や組み換えタンパク質によるインキュベーションは、隣接する筋線維上の筋肉幹細胞のさらなる機能解析のために可能です。
