Work was funded by MRC grant G1002118.

Todo el trabajo de los animales se realizó de acuerdo con las directrices institucionales bajo licencia por el Ministerio del Interior del Reino Unido (número de licencia del proyecto PPL 60/1726 y 60/4026). Nota: animales Casa de conformidad con los requisitos legales del Reino Unido en una luz 14 horas y 10 horas oscuridad fotoperíodo. Realizar experimentos en animales utilizando ratones C57BL6J tipo salvaje, ratones Tau-GFP que tienen expresión ubicua de la proteína fluorescente verde (GFP) 8, y los ratones Thy1-YFP con la expresión ocasional de la proteína fluorescente amarilla (YFP) en un subconjunto de células neuronales 9: ambas líneas transgénicas fueron criados en un fondo C57BL6J. 1. Condiciones de trabajo y elaboración de instrumentos <ol><li> Realizar toda la preparación de medios de comunicación, las disecciones de tejidos, y el trabajo de cultivo en una campana de flujo laminar para asegurar la esterilidad: esto evita el requisito de la adición de antibióticos a los medios de comunicación. </li><li> Permita siempre que los medios de comunicación / cultura placas / platos de embriones se equilibrendurante al menos 1 hora, en un horno de 37 ° C (medio de disección / platos de embrión) o 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora (medio y placas de cultivo), antes de su uso. </li><li> Remojar pipetas de vidrio en solución al 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA) durante alrededor de una hora y, a continuación dejar secar. Tire pipetas en la llama de un mechero Bunsen, doblando el cristal mientras lo hace, para producir pipetas de vidrio curvado finamente dibujados. Después se extrae la pipeta, hacer un corte limpio con un cortador de vidrio. Esterilizar horno a 160 ° C durante alrededor de 45 minutos. NOTA: Una tienda de estas pipetas de vidrio será necesario transferir los ovarios y los folículos. </li></ol> 2. Preparación de la disección y Medios de Cultivo <ol><li> Preparar Disección Medio. <ol><li> Disolver 3 mg / ml de BSA en medio Leibowitz L15 y esterilizar por filtración a través de un 0,2 micras de poro, filtro de 25 mm de diámetro. </li></ol></li><li> Neonatal Ovario Cultura. <ol><li> Para preparar el medio para el cultivo de ovario neonatal, hacer 1 ml de medio para each ovario que se cultivó. Disolver 3 mg / ml de BSA en-α Medio Esencial Mínimo (aMEM) y el filtro de esterilización de 0,2 micras a través de un poro, filtro de 13 mm de diámetro en un tubo estéril. </li><li> Para preparar las placas para la cultura ovario neonatal, añadir 1 ml de medio de cultivo ovario neonatal en cada pocillo (un ovario por pocillo) de una placa de 24 pocillos. Con unas pinzas estériles relojero, coloque una membrana de policarbonato en la parte superior del medio en cada superficie bien, brillante hacia arriba. UV esterilizar las membranas antes de su uso. </li></ol></li><li> Folículo Cultura. <ol><li> Para preparar medio para el cultivo del folículo, los medios de comunicación esencial suplemento de α-mínimo con 1 UI / ml de la hormona estimulante del folículo humana recombinante, ácido ascórbico 5 g / ml y 5% v / v de suero obtenidas de ratones hembra adultos. Esterilizar por filtración a través de un 0,2 micras de poro, filtro de 13 mm de diámetro en un tubo estéril. </li><li> Filtrar esterilizar aceite de silicio a través de un filtro de 0,45 micras de diámetro de poro, 25 mm, en un tubo estéril. </li><li> Para preparar plates, coloque 30 gotas mu l de medio de cultivo de folículos en cada pocillo de una cultura no-tejido tratado de 96 pocillos de microtitulación placa de ida y así, utilizando sólo la fila superior de cada placa (para permitir que los folículos que se trasladaron a las nuevas filas cada día más el período de cultivo). Superponer cuidadosamente medio con 70 l de aceite de silicona esterilizado, para prevenir medio de la evaporación. </li></ol></li><li> -Folículo ovario Co-cultura. <ol><li> Preparar medio para-folículo del ovario de co-cultivo como para cultivo de folículos en el paso 2.3.1 anterior, lo que representa 1 ml de medio para cada co-cultivo-folículo del ovario está estableciendo. </li><li> Para preparar las placas, añadir 1 ml de medio en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Con unas pinzas estériles relojero, coloque una membrana Nucleopore en la parte superior del medio en cada superficie bien, brillante hacia arriba. UV esterilizar las membranas antes de su uso. </li></ol></li></ol> 3. Neonatal Ovario Disección y Cultura <ol><li> Colocar 1 ml de medio de disección en cada placa de embriones de vidrio estéril. </li> &lt;li&gt; Cull crías de ratón neonatales de edades comprendidas entre 0 y postnatal día 5, el sacrificio por decapitación de acuerdo a las regulaciones del Reino Unido Home Office. </li><li> Sujete la piel que cubre la pared abdominal con un par de pinzas de disección finas y hacer una gran incisión en la pared de la piel y el cuerpo. Abra la incisión para que todo el abdomen se expone. La vejiga se llena de sangre por lo general en esta etapa y puede ser perforado para hacer más fácil la disección. </li><li> Mueva las tripas fuera del camino con unas pinzas relojero. Siga los cuernos uterinos de la vejiga al riñón a cada lado. El ovario se encuentra justo debajo del riñón en la parte superior del útero y aparecerá como una estructura similar a la nube con un microscopio de disección. </li><li> Sujete el ovario suavemente con fórceps relojero, y usar las tijeras para cortar su conexión con el útero. Transferir el par de ovarios en platos de embriones que contienen medio disección pre-calentado. </li><li> Realizar fina disección de ovarios bajo un microscopio de disección en un sta climatizadage (37 ° C). Use agujas de insulina para recortar el saco de la bursitis y cualquier exceso de material incluyendo la trompa de Falopio, hasta que sólo el ovario permanece. </li><li> Transferir cada ovario en el pocillo de una placa de cultivo preparado en la etapa 2.2.2 anterior, usando una pipeta de vidrio curvada finamente dibujado, uno de los ovarios en la parte superior de cada membrana (véase la Figura 1A). Cultura en un 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> Cambiar el medio cada segundo día. Utilizar una pipeta para intercambiar el 50% del medio de cada pocillo para la pre-cámara de gas fresco medio: colocar la punta de la pipeta en el borde del pozo de medio para evitar molestar a la membrana. </li><li> Mantener culturas para hasta 6 días. </li><li> Al final del cultivo, la congelación medio y fijar o congelar los ovarios después de un breve lavado en PBS, según se requiera. <ol><li> Fijar ovarios en fijador de Bouin durante 90 min para el análisis histológico, o en 10% de formalina tamponada neutra durante 90 min para el análisis inmunohistoquímico. Snap congelar ovarios mediante la colocación de tejido enun tubo de polipropileno, colocando el tubo en hielo seco durante 5-10 minutos antes de la congelación a -70 ° C para su posterior extracción de proteína o mRNA. </li></ol></li></ol> 4. folículo Disección y Cultura <ol><li> Cull 19-23 días de edad ratones hembra y aislar los ovarios. Humedezca la piel con etanol al 70% antes de hacer ninguna incisión. Pellizcar la piel con unas pinzas sin punta y hacer una incisión grande en el abdomen con tijeras de disección, penetrando a través de la piel y la pared del cuerpo. </li><li> Mueva el intestino fuera del camino utilizando un conjunto más fino de los instrumentos de disección y localizar el útero. Siga el útero hasta el ovario que se encuentra por debajo de la de riñón en cada lado. </li><li> Agarrando suavemente el ovario mediante un par de pinzas relojero, cortar los ovarios conexión con el útero con tijeras de disección finas. Evitar la recogida demasiado de la almohadilla de grasa de ovario. Recoge los ovarios y transferir a un embrión platos que contenían medio disección pre-calentado. </li><li> Remover la bolsa ovárica utilizando agujas de insulina para recortar el saco de la bursitis y cualquier exceso de material incluyendo la trompa de Falopio, hasta que sólo el ovario permanece. Aproximadamente reducir a la mitad cada ovario usando agujas de insulina. </li><li> Transfiera cuidadosamente cada ovario-media en un vidrio de reloj individual que contiene 1 ml de medio de disección. Cubrir cada vidrio de reloj con un portaobjetos de vidrio para evitar la evaporación del medio y para asegurar la esterilidad. </li><li> Vidrios de reloj tienda que contienen mitades de ovario en un horno de 37 ° C hasta que sea necesario, pero llevar a cabo el siguiente paso disección tan pronto como sea posible. Deseche tejido almacenado de esta manera por más de una hora. </li><li> Vidrio de reloj de transferencia que contiene un medio de ovario a una platina de microscopio calentado 37 ° C en una campana de flujo laminar. Aproximadamente diseccionar ovario en grandes piezas con dos agujas de insulina, a fin de identificar finales de los folículos pre-antrales como sigue: éstos contendrán 2-3 capas de células de la granulosa y tienen un diámetro de alrededor de 180-200 micras. </li><li> Diseccionar manualmente cualquier ifolículos dentified utilizando una aguja de insulina y una de 30 x 0,25 mm aguja de acupuntura que ha sido asegurada en un soporte de la aguja. Tenga cuidado de eliminar la mayor parte del estroma circundante, pero no dañar la lámina basal de los folículos (véase la Figura 1B). </li><li> Utilice una pipeta de vidrio curvo finamente elaborado para transferir cuidadosamente folículos disecados en un vidrio de reloj que contiene medio de la recolección de la disección pre-calentado. Tenga cuidado de mantener los folículos dentro de la sección de calibre fino de pipeta para evitar la pérdida de los folículos. </li><li> Folículos Medir con precisión utilizando una retícula ocular calibrado montado en un microscopio de disección. </li><li> Seleccione folículos para la cultura sólo si miden 190 ± 10 m de diámetro. Además seleccionar solamente, folículos esféricos saludables para la cultura; estos serán translúcido, sin zonas oscuras atretic, y tienen una lámina basal intacta, junto con parte del tejido tecal adjunto: descartar los folículos que no encajan en esta descripción. Un rendimiento de entre 10-15 folículos por ovario es bueno. </li><li> Usar una pipeta de vidrio curvada finamente dibujado para transferir un único folículo en el pocillo de una placa hecha como en el paso 2.3.3 anteriormente. Colocar con cuidado el folículo en el fondo del pozo (y no en la capa de aceite superior). Cultura en un 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> Folículos de cultivo para hasta 6 días, moviendo los folículos en un medio fresco que contiene así todos los días. <ol><li> Preparar la siguiente fila en la placa de 96 así como en la preparación de la placa en el paso 2.3.3. Placa de retorno a la incubadora durante al menos una hora, para permitir el equilibrio. Traslado folículos en los pozos frescas de medio, con una pipeta de vidrio finamente dibujado. </li><li> Si en cualquier punto en la cultura folículos se deben dejar durante dos días antes de pasar a medio fresco, colocar cada folículo en un mínimo de 60 l (en lugar de 30 l) gotas de medio de cultivo folículo. </li></ol></li><li> Para recoger datos sobre el crecimiento del folículo, medir los folículos diario, utilizando un eyretícula epiece montado en un microscopio de disección. La capa de aceite distorsionará mediciones del diámetro del folículo, así calcular el coeficiente de calibración para la puesta a punto. </li><li> Al final del cultivo, la congelación medio y fijar o congelar el tejido para su posterior análisis, como en el paso por encima de 3,10. </li><li> Folículo folículo Co-cultura. <ol><li> Cultura dos folículos juntos, para investigar las interacciones entre los folículos. Cultura como anteriormente, pero el lugar dos folículos de lado a lado, en contacto, en un pozo. </li><li> Coloque 100 l gotas de medio de cultivo de folículos en cada pocillo de una cultura no tejido tratado de microtitulación de 96 pocillos de placa plana así, superponiendo medio con 100 l de aceite de silicona esterilizado. No transferir los folículos en los pocillos frescos como en el paso por encima de 4,13, pero en lugar de utilizar una punta fina de gel para cambiar 50% del medio cada dos días. </li><li> Con el fin de identificar los orígenes de tejido dentro de la co-cultivo, de co-cultivo folículos cada uno de una fuente genética diferente, por ejemplo one desde el ovario de un ratón de tipo salvaje, y el otro desde el ovario de un ratón con expresión ubicua de GFP. Si el uso de GFP o tejido YFP, minimizar la exposición del tejido a la luz tanto como sea posible, durante el cultivo, ya través de los pasos de fijación / procesamiento a partir de entonces. NOTA: Es normal que los dos folículos crezcan juntos en una sola unidad de dos folículo &#39;(ver Figura 1 C). </li></ol></li></ol> 5. Co-culturas-folículo del ovario <ol><li> Disecar los ovarios y los folículos fuera como en las secciones 3 y 4 anteriores. </li><li> Coloque un ovario neonatal en la parte superior de una membrana, en una placa preparada como en el paso 2.4.2 anteriormente. Con cuidado, coloque un único folículo en contacto con uno de los polos del ovario neonatal, usando una pipeta de vidrio curvada finamente dibujado. Cultura en un 37 ° C, 5% de CO2 durante un máximo de 5 días. </li><li> Con el fin de distinguir entre el origen del tejido dentro del co-cultivo, utilizar los ovarios y los folículos de dos diferentes asíURCES, por ejemplo, uno de un tipo de ratón salvaje, y otro de un ratón con expresión ubicua de las buenas prácticas agrarias. </li><li> Reemplazar 500 l de medio diario como en el paso 3.8 anterior, pero utilizando medio de cultivo folículo. Durante la co-cultura, el folículo menudo queda encapsulado por el ovario (Figura 1D). </li><li> Al final del cultivo, la congelación medio y fijar o congelar el tejido para su posterior análisis, como en el paso por encima de 3,10. </li></ol> 6. Fijación, inmunocitoquímica e Imagen de tejido cultivado <ol><li> Al final del cultivo, el lavado de tejidos en PBS y transferir a 100 l (folículo) o 1 ml (ovario) de 10% de formalina tamponada neutra, y fijar, por 1 hora en hielo. Moverse a través de 3 lavados de 1x PBS a 4 ° C. </li><li> Para inmunocitoquímica sobre los folículos, la transferencia entre los pocillos de una placa de microtitulación de ida y bien 96 pocillos usando una pipeta de vidrio curvada finamente dibujado, conteniendo cada pocillo diferentes lavados o tratamientos. </li><li> Por inmunocitoquímica en OvariEs (o co-cultivos-ovario folículo), incrustar en el 4% en gel de agarosa y la sección a 50 micras utilizando un vibrotomo. Secciones flotar en los pocillos de una placa de 24 pocillos para aplicar lavados o tratamientos, la eliminación con una pipeta. </li><li> Para imágenes: transferir secciones de agarosa a portaobjetos de vidrio plano y montar con medio de montaje; o folículos de transferencia (o complejos folículo folículo) a portaobjetos de vidrio de la cavidad y se montan con que no se endurezca medio de montaje. Especímenes de imagen utilizando un microscopio confocal. </li></ol>

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	<li>Brien, M. J., Pendola, F. L., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+protocol+for+in+vitro+development+of+mouse+oocytes+from+primordial+follicles+dramatically+improves+their+developmental+competence.">A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence.</a> Biol. Reprod. 68 (5), 1682-1686 (2003).</li><li>Fortune, J. E., Yang, M. Y., Muruvi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+earliest+stages+of+follicle+development:+follicle+formation+and+activation.">The earliest stages of follicle development: follicle formation and activation.</a> Soc. Reprod. Fertil. Suppl. 67, 203-216 (2010).</li><li>McLaughlin, M., Kinnell, H. L., Anderson, R. A., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+phosphatase+and+tensin+homologue+(PTEN)+in+human+ovary+in+vitro+results+in+increased+activation+of+primordial+follicles+but+compromises+development+of+growing+follicles.">Inhibition of phosphatase and tensin homologue (PTEN) in human ovary in vitro results in increased activation of primordial follicles but compromises development of growing follicles.</a> Mol. Hum. Reprod. 20 (8), 736-744 (2014).</li><li>Morgan, S., Lopes, F., Gourley, C., Anderson, R. A., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin+and+doxorubicin+induce+distinct+mechanisms+of+ovarian+follicle+loss;+imatinib+provides+selective+protection+only+against+cisplatin.">Cisplatin and doxorubicin induce distinct mechanisms of ovarian follicle loss; imatinib provides selective protection only against cisplatin.</a> PLoS One. 8 (7), e70117 (2013).</li><li>Murray, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+growth+and+oocyte+competence+in+the+in+vitro+cultured+mouse+follicle:+effects+of+gonadotrophins+and+steroids.">Follicular growth and oocyte competence in the in vitro cultured mouse follicle: effects of gonadotrophins and steroids.</a> Mol Hum Reprod. 14 (2), 75-83 (2008).</li><li>Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effect+of+follicle-follicle+interactions+and+declining+follicle-stimulating+hormone+on+murine+follicle+health+in+vitro.">Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro.</a> Biol. Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).</li><li>Campbell, L., Trendell, J., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cells+migrating+from+the+thecal+layer+of+ovarian+follicles.">Identification of cells migrating from the thecal layer of ovarian follicles.</a> Cell Tissue Res. 353 (1), 189-194 (2013).</li><li>Pratt, T., Sharp, L., Nichols, J., Price, D. J., Mason, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+and+transgenic+mice+ubiquitously+expressing+a+tau-tagged+green+fluorescent+protein.">Embryonic stem cells and transgenic mice ubiquitously expressing a tau-tagged green fluorescent protein.</a> Dev. Biol. 228 (1), 19-28 (2000).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Maiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reply+to:+cisplatin-induced+primordial+follicle+oocyte+killing+and+loss+of+fertility+are+not+prevented+by+imatinib.">Reply to: cisplatin-induced primordial follicle oocyte killing and loss of fertility are not prevented by imatinib.</a> Nat. Med. 18 (8), 1172-1174 (2012).</li><li>Spears, N., Bruin, d. r., Gosden, J. P., G, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+follicular+dominance+in+co-cultured+mouse+ovarian+follicles.">The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles.</a> J. Reprod. Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).</li><li>Desmeules, P., Devine, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+ovotoxicity+of+cyclophosphamide+metabolites+on+cultured+mouse+ovaries.">Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries.</a> Toxicol. Sc. 90 (2), 500-509 (2006).</li><li>Tagler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+extracellular+matrix+remodelling+via+ascorbic+acid+enhances+the+survival+of+primary+ovarian+follicles+encapsulated+in+alginate+hydrogels.">Promoting extracellular matrix remodelling via ascorbic acid enhances the survival of primary ovarian follicles encapsulated in alginate hydrogels.</a> Biotechnol. Bioeng. 111 (7), 1417-1429 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Se describe aquí diferentes sistemas de cultivo que pueden ser utilizados para apoyar el desarrollo de los folículos ováricos de ratón in vitro, utilizando ovarios neonatales enteras que contienen sólo las etapas más tempranas del folículo, folículos ováricos preantrales individuales y también co-culturas de los dos tejidos. Cultura de ovarios ratón neonatal apoya el desarrollo ovárico precoz, la iniciación de crecimiento particularmente folículo hasta la etapa de folículo secundario. Una gama de edades de ratones recién nacidos se puede utilizar para estos cultivos, dependiendo de las etapas de desarrollo de interés. Si los ovarios se obtienen de ratones recién nacidos, la formación del folículo se pondrán en marcha, pero aún no se completa: cultura apoyará al menos parcialmente, la formación continua folículo seguido por el crecimiento del folículo. Alternativamente, el uso de los ovarios de ratones alrededor de cuatro a cinco días de edad (por el cual la formación del folículo tiempo ya está completo) resulta en la cultura de un mayor número de Folli primordial y crecienteculos 12. Aspectos beneficiosos de la técnica específica descrita aquí incluyen el uso de membranas de policarbonato flotantes, que permiten una mayor oxigenación del tejido, y cultivo en un medio muy básico que consta de sólo aMEM y BSA, evitando el uso de aditivos no definidos tales como el suero. Cultura de toda ovarios no parece apoyar el desarrollo más allá de la etapa de folículo secundario, con el desarrollo posterior que requiere un cambio en la técnica, tales como la disección de los complejos de células de la granulosa del folículo del ovario neonatal cultivaron 1. Las etapas posteriores de desarrollo del folículo se pueden desarrollar in vitro mediante la disección a cabo individual, finales de los folículos antrales pre-intactas, que se puede cultivar a la fase preovulatoria en cultivo, mientras que el mantenimiento de su estructura tridimensional. El uso de los folículos intactos para esta técnica de cultivo mantiene la relación entre los diferentes componentes foliculares como ocurre in vivo. This sistema de cultivo puede ser utilizado para obtener ovocitos que pueden apoyar la fecundación y el desarrollo embrionario posterior. Ovocitos fertilizables también se pueden obtener a partir de ovarios de ratones neonatales usando un protocolo de cultivo inicial mucho como se describe aquí, seguido de una segunda etapa durante la cual los complejos ovocito y las células de la granulosa se ​​cultivan in vitro 1. Otros sistemas utilizados con bastante frecuencia hoy en día incluyen el cultivo de folículos o tejido ovárico que ha sido encapsulados en un material tal como hidrogel de alginato, para proporcionar apoyo (véase, por ejemplo, Tagler et al. 13). Gran parte de la atención del desarrollo del método ahora es mejorar las técnicas de cultivo para los ovarios y los folículos de los mamíferos más grandes, con el objetivo a largo plazo de la obtención de los ovocitos de folículos primordiales fecundables a partir de una variedad de especies, incluyendo los seres humanos. En cualquier momento, los ovarios de mamíferos contienen folículos en una gama de etapas de desarrollo, con Interactions entre folículos que afectan a su regulación. Este aspecto de la función ovárica es poco conocida y difícil de examinar in vivo. El último método descrito aquí utiliza sistemas de co-cultivo para apoyar el desarrollo de las diferentes etapas de folículos in vitro. Si es necesario, uno o ambos tejidos pueden ser tratados previamente para co-cultivo antes in vivo o in vitro. Sistemas de co-cultivo como éste ofrecen una forma ideal para examinar las interacciones folículo folículo, por ejemplo, cómo cada vez mayor, los folículos antrales afectan a la piscina folículo primordial, aspectos de la biología de ovario que han demostrado ser difíciles de examinar hasta ahora. Las técnicas de cultivo de ovario de enteros son bastante sencillo, aunque se requiere disección cuidadosa para evitar daños en los tejidos accidental. Disección de los folículos individuales es una técnica especializada, que requiere práctica repetida antes de folículos en la fase de derecho pueden diseccionaron del ovario intacto y sin daños. Es críticoa diseccionar los folículos individuales con cuidado, o daños sufridos durante el protocolo de disección puede provocar la muerte del folículo durante el período de cultivo posterior. Cuando los folículos se colocan directamente en el pocillo de placas de microtitulación, es importante usar sólo plásticos cultura no tejido tratado, para minimizar chapado abajo de las células tecales en los plásticos: si se utiliza material de plástico tratado de cultivo de tejido, los folículos se adherirá a las base del pocillo y ruptura a medida que crecen. Para todos los trabajos de co-cultivo, los tejidos deben ser colocados directamente en contacto uno con el otro. El medio se detalla anteriormente para uso en la técnica de cultivo del folículo incluye la adición de suero de ratón. Es posible sustituir el suero de ratón con suero bovino fetal, pero sólo los lotes ocasionales de tales sueros apoyará plenamente el desarrollo del folículo a la fase preovulatoria, con lotes de prueba necesaria para identificar fuentes adecuadas. Batch-prueba de FSH también es recomendable, ya que el Uni Internacionalts por el cual la FSH se evalúa correlato sólo crudamente al crecimiento del folículo in vitro. Si la ruptura del folículo se produce habitualmente durante el período de cultivo, considerar la sustitución de ácido ascórbico Stock con un nuevo lote. Las técnicas no requieren equipo especializado particularmente distinta de microscopios de disección e incubadoras de cultivo de tejidos, aunque el uso de una campana de flujo laminar y una buena técnica estéril permite que los folículos ováricos que se cultivaron en ausencia de antibióticos, como en los métodos descritos aquí. Esto puede ser útil, para evitar cualquier potencial efecto perjudicial de los antibióticos en los ovocitos, particularmente si son para ser fertilizado después del cultivo. Cuando no sea posible trabajar en un ambiente estéril, es aconsejable añadir antibióticos a los medios de disección y la cultura.

El ovario de mamífero se compone de suministro de por vida de una mujer de oocitos, cada uno contenido dentro de un folículo ovárico. Los folículos se forman antes del nacimiento en el reposo, la etapa primordial: una vez establecida la piscina folículo, hay un movimiento continuo y gradual de los folículos de la primordial en la piscina folículo en crecimiento. Como los folículos empiezan a crecer, se desarrollan a través de las etapas primarias, secundarias, preantral y luego antrales, hasta que alcancen el preovulatorio, o de Graaf, etapa. Solamente los ovocitos de folículos preovulatorios tienen competencia de desarrollo completo, capaz de apoyar el desarrollo embrionario a plazo, si fertilizado. El ovario mucho tiempo se ha sabido para desarrollar de una manera altamente fisiológica in vitro. Esto es probable que sea debido a cada folículo ovárico que contiene en su interior las células necesarias para apoyar un ovocito de la etapa inmadura (momento en el que es incapaz de completar su división meiótica) a través de tque etapa de desarrollo competente (momento en el que puede apoyar plenamente la finalización de la meiosis, la fertilización y el desarrollo del embrión resultante a término). La naturaleza fisiológica de desarrollo de ovario in vitro ha llevado a la amplia utilización de técnicas de cultivo de ovario. En consecuencia, los métodos in vitro se han utilizado para investigar la regulación del desarrollo de ovario, patología ovárica (por ejemplo la del síndrome de ovario poliquístico, síndrome de ovario poliquístico), el examen de cómo ovarios / ovocitos se ven afectados por la exposición a los productos químicos, y también con el objetivo práctico de la obtención de ovocitos fertilizables de folículos ováricos primordiales. Hasta la fecha, este último sólo se ha conseguido a través del ratón tejido ovárico 1, aunque las técnicas de cultivo utilizando los folículos de los grandes mamíferos, incluidos los humanos, han mejorado mucho en los últimos años 2,3. Se describe aquí varios métodos de cultivo utilizando tejido ovárico ratón. La primera method utiliza enteros ovarios de ratones neonatales, y apoya la formación y el desarrollo temprano de los folículos primordiales 4. El segundo sistema soporta el crecimiento de los folículos ováricos individuales, intactos de finales del preantral a la fase preovulatoria; utilizando esta técnica, los folículos pueden ser cultivadas individualmente, o en parejas 5,6. Por último, se describe un sistema de co-cultivo, la combinación de las dos primeras técnicas en un método que permite la investigación de las interacciones entre el cultivo y los folículos ováricos primordiales 7. Cultura de los folículos ováricos intactos individuales permite el crecimiento del folículo que se determinará a partir de mediciones del folículo diarios durante el período de cultivo, mientras que el análisis medio permite la investigación de folículo / producción hormonal del ovario. Otros análisis de tejidos pueden ser alcanzados por una colección de folículos o tejido ovárico en el extremo de la cultura, para los análisis histológicos / o inmunohistoquímico para su posterior procesamiento, por ejemplo, para obtenerARNm o proteínas.

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	<tbody>
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		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Leibowitz L15</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">11415049</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">&#945;MEM</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">22571020</td>
			<td style="width:265px;">Supplied as sodium bicarbonate buffered (2200 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A9418</td>
			<td style="width:265px;">For dissection medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A3311</td>
			<td style="width:265px;">For culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A2153</td>
			<td style="width:265px;">For coating glass pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Mouse serum</td>
			<td style="width:159px;">-</td>
			<td style="width:151px;">-</td>
			<td style="width:265px;">Collected from cardiac puncture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">FSH</td>
			<td style="width:159px;">Merck Serono</td>
			<td style="width:151px;">Gonal F</td>
			<td style="width:265px;">Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10&#181;l in &#945;MEM and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A4034</td>
			<td style="width:265px;">Make up stock of 5mg/ml in &#945;MEM and store at -20&#176;C.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Silicon oil</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:151px;">630064V</td>
			<td style="width:265px;">Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Syringe filters (25mm, 0.2&#181;m)</td>
			<td style="width:159px;">Greiner</td>
			<td style="width:151px;">16532K</td>
			<td style="width:265px;">Cellulose acetate filter: for filtering larger (&#62; 5mls) volumes of medium.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Syringe filters (13mm, 0.2&#181;m)</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">3032-013</td>
			<td style="width:265px;">Cellulose acetate filter: for filtering smaller (&#60; 5mls) volumes of medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Syringe filters (25mm, 0.45&#181;m)</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">2053-025</td>
			<td style="width:265px;">Cellulose acetate filter: for filtering oil.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Sterile tubes</td>
			<td style="width:159px;">Greiner</td>
			<td style="width:151px;">187261</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">24 well plate</td>
			<td style="width:159px;">Greiner</td>
			<td style="width:151px;">662160</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">96 well round bottom plate</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">3875-096</td>
			<td style="width:265px;">Use only non-tissue culture treated plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">96 well flat bottomed well</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">3860-096</td>
			<td style="width:265px;">Use only non-tissue culture treated plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Whatman nucleopore membranes</td>
			<td style="width:159px;">Camlab</td>
			<td style="width:151px;">WN/110414</td>
			<td style="width:265px;">Use shiny surface up, polycarbonate, 13mm diameter, 8.0&#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Insulin needles</td>
			<td style="width:159px;">BD medical supplies</td>
			<td style="width:151px;">037-7606</td>
			<td style="width:265px;">0.33mm (29G) +1ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Glass embryo dishes</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:151px;">720-0579</td>
			<td style="width:265px;">Sterilise then warm before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Glass pipettes</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">10209381</td>
			<td style="width:265px;">BSA coated before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Gel tips</td>
			<td style="width:159px;">AlphaLabs</td>
			<td style="width:151px;">LW1103</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Acupuncture needles</td>
			<td style="width:159px;">Acumedic LTD</td>
			<td style="width:151px;">30mmx0.25 Type C</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bouin&#8217;s fixative&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">HT10132-1L</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>HT5014-120ml</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">1.5 ml polypropylene tubes</td>
			<td style="width:159px;">Greiner BioOne</td>
			<td align="right">616201</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and co-culture of mouse ovaries and ovarian follicles

El ovario de los mamíferos está compuesto de los folículos ováricos, cada folículo que consta de un solo ovocito rodeado por células de la granulosa somáticas, encerrado juntos dentro de una membrana basal. Una piscina finito de folículos se establece durante el desarrollo embrionario, cuando los ovocitos en detención meiótica forman una estrecha asociación con las células de la granulosa aplanadas, formando folículos primordiales. Por nacimiento o poco después, los ovarios de mamíferos contienen la oferta de su vida de folículos primordiales, desde qué punto en adelante hay una liberación constante de folículos en el creciente piscina folicular. El ovario es particularmente susceptibles al desarrollo in vitro, con folículos en crecimiento de una manera altamente fisiológica en cultivo. Este trabajo describe la cultura de ovarios neonatales enteras que contienen folículos primordiales, y la cultura de los folículos ováricos individuales, un método que puede apoyar el desarrollo de los folículos de un inmaduro hasta el preovumentación etapa, después de lo cual sus ovocitos son capaces de someterse a la fertilización in vitro. El trabajo descrito aquí utiliza sistemas de cultivo para determinar cómo el ovario se ve afectada por la exposición a compuestos externos. También se describe un sistema de co-cultivo, que permite la investigación de las interacciones que se producen entre los folículos en crecimiento y la no-creciente número de folículos primordiales.

La Figura 1 muestra imágenes de los ovarios y los folículos en el inicio de, y durante, los procedimientos de cultivo. La Figura 2 muestra los resultados representativos de ovarios neonatales (en este caso, los ovarios de las crías recién nacidas) expuestos a tóxicos para la reproducción durante el cultivo. Ovarios neonatales se cultivaron durante 6 días, y expuestos a un fármaco de quimioterapia, cisplatino o doxorrubicina, en el Día 2 de la cultura. Al final del cultivo, los ovarios se fijaron, se procesaron para histología, y los ovarios examinaron a continuación para determinar el número de folículos ováricos saludables y no saludables 4. Como alternativa, una evaluación más rápida de folículos en crecimiento tempranas se puede obtener de la cultura de fragmentos de ovario, utilizando ovarios de un ratón que expresan un marcador fluorescente-ovocito específicos 10. Durante el cultivo de folículos individuales, el crecimiento del folículo puede ser fácilmente comprobado por mediciones diarias durante el callejóntura período. La figura 3 muestra los resultados representativos del crecimiento de los folículos cultivadas en presencia o ausencia de las hormonas gonadotropinas hormona folículo estimulante (FSH) y la hormona luteinizante (LH) 5. Folículo folículo o folículo del ovario de co-cultivo se pueden utilizar para investigar las interacciones entre folículos. Dependiendo del tejido y el procesamiento, las imágenes se pueden obtener usando de campo brillante, fluorescencia o microscopios confocales. La Figura 4 muestra resultados representativos de imágenes de tales co-cultivos, el examen de diversos tipos de células implicados en la comunicación del folículo folículo, incluyendo las células endoteliales y neuronales 7. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig1highres.jpg" width="650" /> Figura 1: (A) Microfotografía de un ovario neonatal obtenido de un ratón en el día de nacimiento, colocado<html> en una membrana de policarbonato. (B) Fotomicrografía de recién disecados folículo ovárico sano, con la mayor parte del tejido estromal que rodea disecados fuera. (C) Las microfotografías de co-cultivo de dos folículos ováricos durante los tres primeros días de cultivo, mostrando el estrecho contacto que se establece entre los dos folículos medida que avanza la cultura (Ci: primer día de la cultura; Cii: segundo día de la cultura; Ciii : tercer día de la cultura). Reproducido de Spears et al. 11 (D) Microfotografía de co-cultivadas folículo preantral y ovario neonatal después de dos días de cultivo. La imagen muestra el folículo quedar encapsulada por el ovario. La flecha muestra folículo preantral. Imagen del Dr. Federica Lopes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52458/52458fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> gura 2 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52458 / 52458fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2: Efecto de los fármacos de quimioterapia cisplatino y doxorrubicina en ovarios cultivadas neonatales cisplatino y doxorrubicina ambos conducen a la pérdida de la salud del folículo y una reducción del número de folículos.. El cisplatino (A); (B) La doxorrubicina: (i) Porcentaje de los folículos no saludables (borrar); y (ii) el número total de folículos (sombreado) en cada ovario. Bares denotan media + SEM; n = 5 para todos los grupos, estrellas denotan diferencias significativas con respecto al control (* p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001). Reproducido de Morgan et al. 4 <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig3.jpg" width="400" /> Figura 3:. Valores Tasas de crecimiento de los folículos expuestos a diferentes ambientes de gonadotrofina son media ± SEM (n ≥16 para cada grupo). La flecha indica el inicio de antrosl la formación en todos los grupos de gonadotrofina. Reproducido de Murray et al. 5 <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig4highres.jpg" width="650" /> Figura 4: Imágenes del folículo folículo y ovario folículo-co-culturas, mostrando interacciones folículo folículo (A) micrografía confocal de una proteína fluorescente verde (GFP) folículo y una de tipo salvaje (WT) folículo después de co-cultivo (. expresión de GFP se muestra aquí en blanco), con procesos desde el folículo GFP se muestra que se extiende sobre el folículo WT. (B) de la sección transversal a través de un GFP / WT complejo folículo siguiente co-cultivo, mostrando que los procesos de GFP (verde) de la mentira folículo colindante adyacente a la lámina basal del folículo WT. (C) Neonatal WT ovario tras el cultivo con una expresión de GFP-folículo, que muestra que las células GFP y procesos celulares (verde) pre-antral han migradoa través del intersticio de ovario del ovario neonatal. (D) GFP / WT complejo folículo que contiene células endoteliales, que se muestra por la expresión de CD31 marcador de células endoteliales (rojo). (E) GFP / complejo folículo WT contiene células neuronales, que se muestra por la expresión del marcador neuronal beta tubulina III (ver aquí como el rojo o el amarillo si de doble etiquetado con GFP, verde). Complejo folículo (F) YFP / WT, donde YFP se refiere a folículo de un ratón Thy1-YFP que tiene expresión ocasional de la proteína fluorescente amarilla (YFP: amarillo) en un subconjunto de células neuronales 9, que muestra que las neuronas se extienden desde el folículo YFP. Bares 50 micras (A, B, D), 100 m (C, E, F), 100 micras (inserto en A), 10 micras (recuadro en C), 15 micras (inserción en D). Reproducido de Campbell et al. 7 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52458/52458fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta fi</a>gura.

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Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Este protocolo describe el cultivo primario / co-cultivo de tejido ovárico ratón, utilizando los ovarios de ratones recién nacidos y los folículos ováricos individuales de ratones prepúberes. Las técnicas de cultivo de apoyar el desarrollo de una manera altamente fisiológica, lo que permite la investigación del efecto de los agentes extrínsecos en el ovario, y de las interacciones entre los folículos ováricos.

Cultura y Co-cultura de ratón ovarios y los folículos ováricos

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

culture-and-co-culture-of-mouse-ovaries-and-ovarian-follicles

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

22.5K vistas.  University of Edinburgh.  Este protocolo describe el cultivo primario / co-cultivo de tejido ovárico ratón, utilizando los ovarios de ratones recién nacidos y los folículos ováricos individuales de ratones prepúberes. Las técnicas de cultivo de apoyar el desarrollo de una manera altamente fisiológica, lo que permite la investigación del efecto de los agentes extrínsecos en el ovario, y de las interacciones entre los folículos ováricos. 

Video: Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Un enfoque optogenética para Evaluar formación de conexiones neuronales en un sistema de co-cultura

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex Utero electroporación y organotípicos rebanada Cultura de ratón Hipocampo Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

3D organotípicos Co-cultura de apoyo medular tímica epitelial proliferación celular, la diferenciación y la Expresión Génica Promiscuo Modelo

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

In Vitro Crecimiento de los folículos Preantral ratón bajo microgravedad simulada

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Disección y cultivo de riñón embrionario de ratón

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature maintenance and pathological malformations can result in severe ischemic diseases, while overly abundant vascular development is associated with cancer and inflammatory disorders. A promising form of pro-angiogenic therapy is the use of angiogenic cell sources, which can provide regulatory factors as well as physical support for newly developing vasculature.
Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are extensively investigated candidates for vascular regeneration due to their paracrine effects and their ability to detect and home to ischemic or inflamed tissues. In particular, first trimester human umbilical cord perivascular cells (FTM HUCPVCs) are a highly promising candidate due to their pericyte-like properties, high proliferative and multilineage potential, immune-privileged properties, and robust paracrine profile. To effectively evaluate potentially angiogenic regenerative cells, it is a requisite to test them in reliable and &#34;translatable&#34; pre-clinical assays. The aortic ring assay is an ex vivo angiogenesis model that allows for easy quantification of tubular endothelial structures, provides accessory supportive cells and extracellular matrix (ECM) from the host, excludes inflammatory components, and is fast and inexpensive to set up. This is advantageous when compared to in vivo models (e.g., corneal assay, Matrigel plug assay); the aortic ring assay can track the administered cells and observe intercellular interactions while avoiding xeno-immune rejection.
We present a protocol for a novel application of the aortic ring assay, which includes human MSCs in co-cultures with developing rat aortic endothelial networks. This assay allows for the analysis of the MSC contribution to tube formation and development through physical pericyte-like interactions and of their potency for actively migrating to sites of angiogenesis, and for evaluating their ability to perform and mediate ECM processing. This protocol provides further information on changes in MSC phenotype and gene expression following co-culture.

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Here, we present a novel application of the aortic ring assay where prelabelled mesenchymal cells are co-cultured with rat aorta-derived endothelial networks. This novel method allows visualization of Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) homing and integration with endothelial networks, quantification of network properties, and evaluation of MSC immunophenotypes and gene expression.

El ensayo de co-cultivo del anillo aórtico: Una herramienta conveniente para evaluar el potencial angiogénico de las células mesenquimales estromales In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Disección y la coloración de los ovarios Pupal de Drosophila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Todo Monte inmunofluorescencia y cuantificación del folículo de los ovarios de ratón cultivadas

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

Cultivo de tejido ovárico para visualizar fenómenos en ovario de ratón

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies have demonstrated the wide differentiation capacity that these cells possess. The ovary represents a promising candidate for cell-based therapies due to the fact that it is rich in MSCs and that it is frequently discarded after ovariectomy surgeries as biological waste. This article describes procedures for the isolation, expansion, and differentiation of MSCs derived from the canine ovary, without the necessity of cell-sorting techniques. This protocol represents an important tool for regenerative medicine because of the broad applicability of these highly differentiable cells in clinical trials and therapeutic uses.

Herein, we describe a method for the isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from canine ovarian tissue.

Derivación y diferenciación de células mesenquimales ovárico canino

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...