Este protocolo es útil para la conservación a largo plazo de los ovocitos felinos a través de una técnica de criopreservación conocida con vitrificación, que es crucial para la fertilidad y la preservación de la biodiversidad en especies animales. Las principales ventajas de la vitrificación son su velocidad ya que se puede completar en menos de 17 minutos y su viabilidad en condiciones de campo si hay nitrógeno líquido disponible. El gato doméstico es un modelo viable para felinos en peligro de extinción salvaje.
El desarrollo y optimización de protocolos de criopreservación permitiría establecer biobancos de gametos para programas de conservación de felinos. Comience preparando una placa de vitrificación Repro con tres pozos cónicos en una fila. Añadir 20 microlitros de solución de equilibrio al primer pozo y 300 microlitros de solución de vitrificación al segundo y tercer pocóculo.
Para equilibrar los complejos de ovocitos cúmulos, o COC, utilice una pipeta de diámetro pequeño para transferir uno o más complejos al fondo del primer pozo. Añadir lentamente 20 microlitros de solución de equilibrio al borde de la caída y esperar tres minutos, luego añadir otros 240 microlitros de solución de equilibrio y esperar nueve minutos. Mientras espera, prepare una caja con nitrógeno líquido y etiquete un soporte de vitrificación con el experimento o el código de identificación del gato.
Coloque la caja y el soporte cerca del microscopio estéreo. Después de equilibrar los COC, realice la vitrificación en menos de 90 segundos. Para vitrificar los COC, llene la pipeta de diámetro pequeño con la solución de vitrificación del segundo pozo.
Tome los COC de la parte inferior del primer pozo y muévalos a la superficie del segundo pozo. Lave la pipeta con la solución de vitrificación, luego mueva los COC a otra zona del pozo y mezcle la solución circundante. Llene la pipeta con solución de otra zona del pozo.
Mueva los COC y mezcle el medio que los rodea con la pipeta. Repita este proceso una vez más. A continuación, lave la pipeta con la solución de vitrificación del tercer pozo y utilicándola para mover los COC a la parte inferior del tercer pozo.
Una vez más, mezcle la solución circundante. Después de llenar la pipeta con solución de otra zona del pozo, mueva los COC y mezcle la solución. Repita este proceso.
Llene la punta de la pipeta con la solución de vitrificación de otra zona del pozo y utilízla para cargar los COC en la tira del soporte de vitrificación cerca de la punta, luego aspire el medio sobrante. Sumerja inmediatamente el soporte de vitrificación en nitrógeno líquido y utilice abrazaderas para cerrarlo, asegurándose de que permanezca sumergido. Almacene los soportes de vitrificación cargados en una copa y guárdelos en un tanque de nitrógeno líquido de almacenamiento hasta el calentamiento.
Coloque la etapa de calentamiento cerca del microscopio estéreo y enciéndala a 38 grados centígrados. Caliente la tapa de un plato de Petri en la parte superior del escenario, luego transfiera los soportes de vitrificación desde el tanque de almacenamiento a una caja con nitrógeno líquido. Prepare una fila de una placa de reproducción para cada soporte de vitrificación que se va a calentar.
Añadir 300 microlitros de solución de dilución al primer pozo y 300 microlitros de solución de lavado al segundo y tercer pocóculo. Saque la solución de descongelación de la incubadora y deje caer 100 microlitros en la tapa de la placa Petri. Utilice las abrazaderas para abrir el soporte de vitrificación dentro del nitrógeno líquido.
Coloque la tapa de la placa Petri debajo del microscopio estéreo, luego recoja rápidamente el soporte de vitrificación y sumerja su tira en la gota, moviéndola hasta que todos los COC se desprendan. Retire el soporte de la caída tan pronto como esté vacío, pero deje los COC en la solución de descongelación durante un minuto. Llene una pipeta con solución de dilución y utilice para mover los COC de la solución de descongelación hasta la parte inferior del primer pozo con solución de dilución.
Deje los COC allí durante tres minutos. Lave la pipeta con la solución de lavado del segundo pozo, luego tome los COC y muévalos al fondo del segundo pozo. Espera cinco minutos.
Lavar la pipeta con una solución del tercer pozo y utilizarla para mover los COC desde el segundo pozo a la superficie del tercer pozo. Espere a que los COC toquen la parte inferior del tercer pozo. A continuación, repita el proceso con otra área de pozo.
Cuando haya terminado, lave la pipeta con un medio de cultivo y mueva los ovocitos a un plato de cultivo. La gran mayoría de los gametos sobreviven después de la vitrificación y el calentamiento de los ovocitos de acuerdo con este protocolo. Aquí se muestra una imagen representativa de un complejo de ovocitos cúmulos de gato calentado vitrificado viable teñido con diacetato de fluoresceína y yoduro de propidium.
Esta tabla muestra el porcentaje de supervivencia después de la vitrificación, que representa los datos posteriores al calentamiento de los ovocitos destinados a la maduración in vitro. De los 435 ovocitos, 395 sobrevivieron, con una viabilidad general del 90,8% después del calentamiento. Sin embargo, algunos cambios morfológicos se pueden notar después del calentamiento.
Las anomalías morfológicas más frecuentes son cambios en la forma y granulación del ooplasmo, pérdida parcial o a veces total de células cúmulos, y fracturas de zona pellucida. Al intentar este procedimiento, recuerde preparar los medios con antelación para que tengan la temperatura correcta antes de su uso y seguir las temperaturas y los tiempos del protocolo para evitar la toxicidad celular. El protocolo también podría aplicarse a los ovocitos de otras especies.
Si tiene éxito, esto también podría contribuir a la banca de germoplasma para la preservación de la biodiversidad en felinos en peligro de extinción.
