Este método hace posible la obtención de imágenes crioeográficas de súper resolución en células biológicas enteras para identificar con precisión las estructuras celulares. También se puede utilizar junto con otras modalidades como parte de un flujo de trabajo de imágenes correlativas. Las principales ventajas de esta técnica son que las imágenes de súper resolución se pueden realizar rápidamente en condiciones criogénicas utilizando fluoróforos convencionales y dosis de luz relativamente bajas.
CyroSIM es una poderosa herramienta que proporciona información para comprender la dinámica de la ultraestructura celular en respuesta a señales internas o externas. Su aplicación incluye la producción y el despliegue de vacunas, el control de calidad, la vigilancia posterior a la comercialización, la ingeniería y optimización de anticuerpos, así como la caracterización de nanopartículas. La maniobra de muestras dentro de la etapa crio-etapa requiere práctica para garantizar la seguridad de la rejilla.
También es mejor familiarizarse con los controles en la ventana Cockpit antes de la recopilación de datos. Para comenzar, retire la tapa del Dewar externo de la etapa crio-etapa y vierta nitrógeno líquido filtrado hasta que esté aproximadamente un cuarto lleno. Espere hasta que la ebullición inicial disminuya antes de verter más y llene el recipiente hasta aproximadamente dos tercios lleno.
Reemplace la tapa con cuidado, apuntando la boquilla lejos del manipulador a medida que el nitrógeno líquido hierve. Una vez que el nitrógeno líquido haya dejado de salir de la salida, coloque la tubería de salida sobre el escenario Dewar en el escenario crioescépico. Conecte la fuente de alimentación, conecte el cable USB y conecte el Dewar externo al escenario.
Después de la entrega de nitrógeno líquido, presione el botón de liberación en la etapa crio-etapa para permitir que ingrese a la cámara de muestra y espere de 30 a 45 minutos para que el sistema se enfríe y estabilice antes de comenzar con la adquisición de imágenes. Utilice la llave hexagonales de la herramienta de casete para abrir las dos placas del casete de transferencia de muestras. Abra las placas lo suficientemente anchas como para dejar caer la rejilla entre las dos placas, pero no abra a la posición máxima.
Use forrórceps largos para levantar la caja de la rejilla de muestra del nitrógeno líquido. Gire para que la muesca se alinee con la posición de almacenamiento dentro del escenario y colóquela en el escenario. Utilice el dispositivo adecuado para abrir la tapa de la caja de almacenamiento en la posición correcta de la muestra.
Usando fórceps invertidos, retire la rejilla TEM del soporte de la muestra, sumérjala dentro del nitrógeno líquido asegurándose de que el lado de la película de carbono esté colocado de modo que finalmente esté frente al objetivo en el puente de muestra y déjalo caer en su posición en el cassette de transferencia de muestra. Cierre el cartucho de muestra con la tecla hexagonl de la herramienta de casete. Utilice el punto magnético de la herramienta de cassette para levantar y montar el cartucho que contiene la rejilla en el puente de muestra.
Manténgalo sumergido o cerca del nitrógeno líquido y en la orientación adecuada. Coloque el cassette plano dentro de los pasadores de posicionamiento del puente y apréndalo suavemente para asegurarse de que esté fijo. Cierre y retire la caja de almacenamiento junto con las muestras restantes.
Mueva la abertura de la tapa de la crioesta etapa a la posición de imagen y apague la luz de la cámara de muestra. Deslice el escenario hacia la óptica para alinearlo debajo de la lente del objetivo, luego deje caer suavemente el objetivo en su posición usando la palanca, asegurándose de que descanse dentro de la tapa del crioescépico, pero no lo toque. Cubra el escenario y la óptica con una cortina negra opaca, luego inicie el software de control Cockpit en la PC crioSIM. Haga clic en el botón de modo de lectura para cada cámara y configárelo en CONV3 megahercios.
Compruebe que la temperatura de cada cámara es de 80 grados centígrados y que el ventilador de la cámara está apagado. Encienda la cámara reflejada, bajo la luz, elija ambiente y debajo de linkam, verifique el condensador y luego haga clic en el botón de modo de video. En la ventana Vista de mosaico, aléjose para ver el contorno de la cuadrícula.
Haga clic en Buscar escenario si no se puede ver y centre la cuadrícula haciendo doble clic izquierdo en el centro del círculo. Utilice las teclas arriba y abajo para enfocar la muestra hasta que la película de soporte de rejilla o cualquier otra característica relevante esté enfocada. Utilice las nueve y tres teclas del teclado numérico para cambiar el paso Z.
Una vez que el escenario esté centrado, desactiva el modo de video. Recopile un mosaico de luz visible haciendo clic en Ejecutar mosaico en la vista de mosaico para producir mosaicos de imágenes de luz visible que se extienden en espiral hacia afuera desde el centro. Guarde la vista haciendo clic en Guardar mosaico.
Inspeccione el mosaico de campo brillante junto con cualquier imagen de mapa de fluorescencia anterior apagando la luz ambiental y el condensador, así como el modo de video, luego encienda el láser de excitación requerido y elija la cámara y el filtro correspondientes, inicialmente a 50 milivatios durante un tiempo de exposición de 50 milisegundos. Presione cero para ajustar una imagen y la estrella para contrastar automáticamente. Alternativamente, ajuste manualmente el contraste utilizando el control deslizante en la parte inferior de la imagen.
Una vez que se hayan encontrado células biológicamente interesantes con fluorescencia adecuada, marque sus posiciones usando el botón de sitio de marca en la vista Mosaico. Continúe marcando todos los sitios potenciales antes de comenzar la adquisición de imágenes. Vuelva a guardar el mosaico con los sitios marcados haciendo clic en Guardar sitios en archivo.
Para unir la imagen de mosaico utilizando el software stitchEm, arrastre y suelte el archivo de mosaico de texto en el archivo stitchEm con la extensión BAT y guarde la imagen TIF combinada de los mosaicos de mosaico en la misma carpeta. Para guardar una imagen con los sitios marcados, arrastre y suelte el archivo de texto de mosaico y el archivo de texto de marcadores en el icono al mismo tiempo. Establezca el tiempo de exposición del láser en función de los recuentos y el rango dinámico en la imagen de fluorescencia en la parte inferior de la ventana de vista de la cámara.
Elija qué filtro aplicar y optimice la configuración para cada longitud de onda de luz de excitación que se utilizará, encendiendo cada láser por separado. Haga clic en ambas cámaras para encenderlas. Regrese a uno de los sitios marcados y concéntrese nuevamente en la profundidad deseada.
Una vez enfocado en un área de interés, desenfocarse usando la tecla de flecha hacia arriba en la ventana XY en el escenario macro para elegir la altura de la pila Z para adquirir y haga clic en Guardar arriba. Salga del foco con la tecla de flecha hacia abajo, haga clic en Guardar abajo, luego en Ir al centro, verifique que la imagen todavía esté enfocada. En la ventana Cockpit, seleccione Experimento de un solo sitio.
En la lista desplegable, seleccione Iluminación estructurada. Modifique la altura de la pila para que sea igual a la altura Z más un micrómetro. Introduzca los tiempos de exposición en milisegundos para los láseres de 405 y 488 nanómetros en la fila superior para la cámara reflejada y los tiempos de exposición para los láseres de 561 y 647 nanómetros en la fila inferior para la cámara transmitida.
Ingrese un nombre de archivo y haga clic en actualizar para producir un nuevo archivo que contenga la fecha y la hora sin anular los archivos anteriores, luego haga clic en Inicio. Si el nitrógeno líquido Dewar rellena la etapa crio-etapa durante la adquisición de la imagen, aborte el proceso haciendo clic en el botón ABORTar en el software Cockpit. En cada posición, recoja una pila Z utilizando luz visible apagando los láseres y encendiendo la luz ambiental y el condensador.
En Experimento de un solo sitio, seleccione Z-stack y ajuste la luz ambiental a 20 milisegundos de exposición, manteniendo la altura Z. Repita este proceso para todos los sitios marcados. Una vez finalizada la obtención de imágenes, desacople el escenario y retire todas las muestras.
Apague la luz de la cámara de muestra. Desenchufe el Dewar externo y decante el nitrógeno líquido restante en otro recipiente compatible con crioterapia, lo que permite que el Dewar vuelva a una temperatura normal de forma segura. Espere hasta que la opción de hornear la pantalla de crio-etapa esté disponible después de que no quede más nitrógeno líquido en la etapa Dewar.
Presione el botón de horneado para ingresar al modo de calentamiento. Coloque el tapón de la tapa en el crioescéfalo. La resolución en crioSIM es significativamente mayor que en la microscopía de epifluorescencia estándar.
El mapa de fluorescencia de un microscopio de epifluorescencia convencional se puede utilizar para localizar áreas de interés para la obtención de imágenes y la imagen crioSIM correspondiente se puede obtener desde una ubicación en la cuadrícula. Una muestra que contenía células U2OS se tiñó con una mezcla de colorante de citoesqueleto de microtúbulos verdes y tinte rojo de mitocondrias, lo que resultó en la tinción del componente de microtúbulos del citoesqueleto y las mitocondrias. Las imágenes posteriores mostraron la localización de las mitocondrias dentro de la célula, así como la disposición de los microtúbulos, destacando el marco estructural que proporcionan a la célula y el ensamblaje del citoesqueleto alrededor de los orgánulos.
El proceso de reconstrucción de SIM puede producir artefactos que se pueden identificar utilizando SIMCheck, un complemento gratuito de imageJ. Este mapa de contraste de modulación generado utilizando SIMCheck muestra áreas de bajo contraste de modulación dentro del área del núcleo, lo que indica que esta región será más susceptible a los artefactos de reconstrucción. La flecha blanca indica un artefacto de reconstrucción.
Al intentar este protocolo, asegúrese de que la muestra permanezca sumergida o cerca del nitrógeno líquido en todo momento para evitar la des-vitrificación. También preste atención a los tiempos de exposición y los recuentos en el rango dinámico, ya que esto afecta la calidad de los datos y evita el daño del láser a la muestra. Después de la crioimagen, las mismas muestras se pueden obtener con otras modalidades, como la tomografía de rayos X criosupresa, que tenemos aquí en la línea de haz B24.
Al combinar imágenes crioSIM con imágenes que contienen información estructural sobre la célula, podemos responder preguntas adicionales clave sobre la ultraestructura y la función celular.
