Pequeñas moléculas de señalización se dirigen a varias proteínas efectoras para controlar la virulencia bacteriana y la biología humana. Sin embargo, estas proteínas efectoras son difíciles de identificar. Como herramienta de biología de sistemas, DRaCALA permite una identificación factible, rápida y altamente sensible de las proteínas efectoras desconocidas mediante el uso de una biblioteca OVium.
DRaCALA podría usarse para estudiar cualquier molécula de señalización pequeña, siempre y cuando se pueda etiquetar con isótopos radiactivos o colorantes fluorescentes. Comience inoculando E. coli en 1.5 mililitros de LB suplementados con 25 microgramos por mililitro de cloranfenicol en cada pozo de placas de pozos de 96 pomos de profundidad para una incubación nocturna a 30 grados Celsius y 160 rotaciones por minuto. A la mañana siguiente, trate los cultivos nocturnos con 500 IPTG micromolar durante seis horas a 30 grados centígrados para inducir la expresión de proteínas.
Al final de la incubación, peletizar las células por centrifugación, eliminar el sobrenadante y congelar las muestras a menos 80 grados centígrados. Para iniciar la lisis, vuelva a colocar los gránulos en 150 microlitros de tampón de lisis uno por pozo durante una incubación de 30 minutos a menos 80 grados centígrados antes de descongelar las células durante 20 minutos a 37 grados centígrados. El lisato debe almacenarse a menos 80 grados centígrados antes de su uso.
Para completar la lisis de las células con proteínas sobreexpresadas, resuspenda las muestras en 40 mililitros de tampón de lisis helada dos y sonicar las muestras a una amplitud del 60% a dos segundos en cuatro segundos apagados durante ocho minutos, luego limpiar los lisados por centrifugación. Mientras se centrifugan las muestras, agregue 500 microlitros de resina de níquel-NTA homogeneizada a una columna de cromatografía de polipropileno en pie. Después de 15 minutos, lave la resina asentada dos veces con 15 mililitros de agua ultrapura y una vez con 15 mililitros de tampón de lisis dos.
Al final de la centrifugación, cargue el sobrenadante lisado despejado sobre la columna. Cuando todo el lisato haya fluido a través de la columna, lave la columna con 30 mililitros de tampón de lavado. Para eludir las proteínas, agregue 400 microlitros de volumen de tampón de elución a la columna y repita la elución tres veces.
Otro volumen de 300 microlitros del tampón de elución para repetir la elución tres veces y combinar las proteínas eluidas en un volumen final de 700 microlitros. Para la filtración en gel de la muestra eluida, después de lavar una columna de exclusión de tamaño con 25 mililitros de tampón de filtración de gel recién preparado, cargue todo el volumen de proteína eluida en la columna utilizando un bucle de 500 microlitros. Ejecute a 500 microlitros por minuto y recolecte de dos a tres fracciones de volumen de 500 microlitros de las proteínas respectivas.
Luego use columnas de espín individuales para concentrar cada proteína y use el kit de ensayo de Bradford para medir las concentraciones de proteínas de acuerdo con los protocolos estándar. Para sintetizar el pentafosfato de guanosina etiquetado con fósforo 32, ensamble una reacción Relseq a pequeña escala en un tubo tapado con tornillo como se describe en la tabla e incube la reacción en un ThermoMixer durante una hora a 37 grados Celsius y cinco minutos a 95 grados Celsius, seguido de cinco minutos en hielo. Al final de las incubaciones, haga girar la proteína precipitada por centrifugación y transfiera el pentafosfato de guanosina sintetizado 32 etiquetado que contiene sobrenadante a un nuevo tubo tapado con tornillo.
Para la síntesis de tetrafosfato de guanosina de fósforo 32, agregue un GppA micromolar a la mitad del producto de pentafosfato de guanosina marcado con fósforo 32 en un nuevo tubo tapado con tornillo e incube la reacción durante 10 minutos a 37 grados Celsius, cinco minutos a 95 grados Celsius y cinco minutos en hielo. Al final de la incubación, haga girar el precipitado por centrifugación y transfiera el tetrafosfato de guanosina etiquetado con fósforo 32 que contiene sobrenadante a un nuevo tubo. Para analizar las proteínas diana aisladas, ejecute un microlitro de cada muestra en una placa de cromatografía de capa delgada utilizando fosfato monopotásico molar de 1,5 como fase móvil.
Después del análisis, coloque la placa seca en una carpeta de plástico transparente y exponga la placa a una pantalla de fósforo de almacenamiento durante cinco minutos antes de visualizar y cuantificar los datos en una imagen de fósforo. Para el cribado DRaCALA de las proteínas objetivo, agregue 20 microlitros de los lisatos al por mayor descongelados a los pozos individuales de una placa de microtitulación de fondo en V de 95 pozos y agregue 2.5 unidades de endonucleasa Serratia marcescens a cada pozo. Después de 15 minutos a 37 grados centígrados, coloque los lisados en hielo durante 20 minutos.
A continuación, mezcle volúmenes iguales de pentafosfato de guanosina y tetrafosfato de guanosina etiquetados con fósforo 32 y agregue 1X tampón de lisis uno a la mezcla para obtener una solución de pentafosfato de guanosina de cuatro nanomolares. Usando una pipeta multicanal y puntas de pipeta filtradas, mezcle 10 microlitros de la mezcla de pentafosfato de guanosina con el lisato celular durante una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave una herramienta de pasador 96X tres veces en una solución al 0,01% de detergente no iónico durante 30 segundos, seguido de 30 segundos de secado en una toalla de papel por lavado antes de colocar la herramienta de pasador en la placa de muestra de 96 pomos.
Después de 30 segundos, levante la herramienta de pasador hacia arriba y colóquela directamente sobre una membrana de nitrocelulosa durante 30 segundos. Después de cinco minutos de secado, coloque la membrana de nitrocelulosa en una carpeta de plástico transparente para almacenar la exposición a la pantalla de fósforo y la visualización por imágenes de fósforo como se ha demostrado. Para cuantificar e identificar posibles proteínas diana, en el software de análisis asociado con el imager de fósforo, abra el archivo de gel de las placas visualizadas.
Para definir los puntos que se analizarán, utilice la función de análisis de matriz para configurar una cuadrícula de 12 columnas por ocho filas. Para circunscribir el borde exterior de los puntos del agujero, defina círculos grandes, exporte el volumen más el fondo y el área de los círculos grandes definidos a una hoja de cálculo. Para circunscribir los pequeños puntos internos, baje el tamaño de los círculos definidos, exporte el volumen más el fondo y el área de los círculos pequeños definidos y guarde todos los datos en la hoja de cálculo.
Coloque los círculos para que se superpongan con los puntos según sea necesario, cambiando el tamaño de los puntos ligeramente más grandes que los reales. Utilice la ecuación para calcular las fracciones de enlace en la hoja de cálculo y trazar los datos. Luego identifique las proteínas de unión potenciales en los pozos que muestran altas fracciones de unión en comparación con la mayoría de los otros pozos.
En este análisis representativo, se puede observar una placa con señales de unión de fondo relativamente bajas en la mayoría de los pozos. La señal de unión positiva en el pozo H3 exhibió una fracción de unión que fue mucho mayor que la observada para los otros pozos debido a la sobreexpresión de la proteína de unión al pentafosfato de guanosina Hpt. En las placas representativas, varios pozos mostraron señales de unión de fondo relativamente más altas, como lo indican los puntos internos relativamente fuertes observados en muchos pozos, así como las fracciones de unión consistentemente altas observadas después de la cuantificación.
En particular, algunos objetivos también dieron fracciones de enlace variables, como los falsos positivos. Para aclarar aún más, los investigadores utilizaron proteínas purificadas para probar la unión nuevamente. Una vez que se identifican las proteínas objetivo, se pueden purificar hasta la homogeneidad y confirmar la fuerza y especificidad de la interacción mediante el uso de DRaCALA, calorimetría de titulación isotérmica u otros métodos.
La identificación de las proteínas diana de pequeñas moléculas de señalización allana el camino para una comprensión profunda de los roles que surgen de la virulencia bacteriana a la biología humana.
