Este protocolo está diseñado para determinar la localización submitocondrial de las proteínas mitocondriales de levadura, que se considera como un paso fundamental durante la elucidación de la función de la proteína mitocondrial. El protocolo es adecuado para nuestras cepas de levadura mantenidas en diferentes condiciones de crecimiento. Representando una poderosa herramienta para la investigación como el estudio de las mitocondrias.
Para empezar, las células de rayas de la cepa de glicerol almacenadas a 80 C, en una placa de agar YPD para aislar colonias individuales de la cepa de interés. E incubar la placa a 30 C durante 2 a 3 días. Prepare un cultivo iniciador inoculando de 2 a 3 colonias individuales de placa de agar YPD en un matraz Erlenmeyer de 100 ml que contenga de 10 a 30 ml de medio YPGal.
Incubar el matraz a 30 C durante 24 horas con agitación vigorosa a 180 a 200 rpm. Diluya el cultivo iniciador en 1 L de medio YPGal fresco a una densidad óptica inferior a 0,1 a 600 nm. Cultive las células a 30 C con agitación vigorosa a 180 a 200 rpm durante aproximadamente 12 horas, hasta que la densidad óptica alcance de 1 a 1.5.
Realizar el aislamiento de mitocondrias altamente purificadas como se describe en el texto. Y determine la concentración de proteínas de la preparación mitocondrial altamente purificada, utilizando el ensayo Bradford, siguiendo las instrucciones del fabricante. Ajuste la concentración de proteína a 10 mg/ml con tampón SEM helado.
Transfiera 40 l de mitocondrias altamente purificadas a cuatro tubos de microcentrífuga preenfriados y etiquetados de 1,5 ml. Añadir 360 l de tampón SEM en el primer y segundo tubo. Y 360 l de tampón EM en el tercer y cuarto tubo.
Usando el esquema de pipeteo, según el texto, agregue 4 L de proteinasa K recién preparada en el segundo y cuarto tubo. Después de mezclar todos los tubos suavemente, incubar en hielo durante 30 minutos con mezcla ocasional. Para detener la actividad de la proteinasa K, agregue 4 L de 200 mM PMSF a los cuatro tubos.
Centrifugar los tubos a 20,000 x g durante 30 minutos a 4 C.Y recoger el sobrenadante, sin molestar el pellet, en un nuevo tubo de microcentrífuga etiquetado preenfriado de 1,5 ml. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 400 l de tampón SEM helado. Para inactivar las posibles trazas de proteinasa K, precipitar el sobrenadante recogido y resuspendir el pellet con ácido tricloroacético hasta una concentración final del 10%Incubar los tubos sobre hielo durante 10 minutos.
Centrifugar las muestras tratadas con ácido tricloroacético durante 10 minutos a 12, 000 x g a 4 C.Y después de retirar el sobrenadante, resuspendir el pellet en 200 l de tampón de muestra. Si el azul de bromofenol se vuelve amarillo, agregue de 1 a 5 l de base 1 M Tris, hasta que se vuelva azul. Añadir 4 l de PMSF de 200 mM a todos los tubos.
Almacene las muestras a 80 C hasta un análisis adicional por SDS-PAGE y western blot. Transfiera 200 l de mitocondrias altamente purificadas a un tubo de microcentrífuga preenfriado de 1,5 ml. Diluya las mitocondrias una sola vez con un tampón SEM helado.
Usando un sonicador compatible con pequeños volúmenes, sonicar las mitocondrias 3 veces durante 30 segundos en hielo. Centrifugar la muestra durante 30 minutos a 100, 000 x g a 4 C.Y recoger el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga preenfriado de 1,5 ml. Después de etiquetar el tubo como S"para la fracción de proteína soluble, mantenga el tubo en hielo.
Vuelva a suspender el pellet del paso anterior en 400 l de tampón SEM helado. Transfiera 100 l del pellet resuspendido a un nuevo tubo de microcentrífuga preenfriado de 1,5 ml. Etiquete el tubo como SMP"para la fracción de partículas de submitochondrial, y mantenga el tubo en hielo.
Diluya los 300 l restantes de pellet resuspendido una sola vez con carbonato de sodio de 200 mM recién preparado. E incubar la muestra diluida en hielo durante 30 minutos. Luego, centrifugue la muestra durante 30 minutos a 100, 000 x g a 4 C.Recoja el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga preenfriado de 1.5 ml.
Etiquete la muestra como CS"para la fracción sobrenadante de carbonato y mantenga el tubo en hielo. Vuelva a suspender el pellet del paso anterior en 400 l de tampón SEM helado. Y nombrar la muestra como CP"para la fracción precipitada de carbonato.
Precipitar todas las muestras con ácido tricloroacético a una concentración final del 10% e incubar los tubos en hielo durante 10 minutos. Luego, centrifugue las muestras durante 10 minutos a 12, 000 x g a 4 C.Después de quitar el sobrenadante, vuelva a suspender cada gránulo en el tampón de muestra. Si el tampón de muestra se vuelve amarillo, agregue de 1 a 5 l de base Tris de 1 M hasta que se vuelva azul.
Agregue 1 l de PMSF de 200 mM a todos los tubos y guárdelo a 80 C hasta un análisis adicional por SDS-PAGE y western blot. La fracción mitocondrial cruda se purificó en la centrifugación por gradiente de densidad de sacarosa, y se observó una reducción en otros contaminantes celulares. La conversión de mitocondrias a mitóticos fue monitoreada por la desaparición de la proteína espacial intermembrana citocromo b2 en el pellet.
Con la aparición concomitante en el sobrenadante. La degradación mediada por la proteinasa K de la proteína intermembrana Sco1 se observó debido a la interrupción de la membrana externa por choque osmótico. La integridad de la membrana mitocondrial externa fue confirmada por la protección del citocromo b2 y Sco1 contra la degradación de la proteinasa K en la fracción de pellets.
Del mismo modo, la protección de la proteína soluble en matriz KGD confirmó la integridad de la membrana mitocondrial interna. El perfil de Western Blot de Prx1 sugirió una localización mitocondrial dual en el espacio intermembrana y la matriz. Las mitocondrias fueron sometidas a sonicación y extracción de carbonato para investigar la topología de las proteínas de membrana.
El vertido integral de proteínas de membrana permaneció en las fracciones de pellets. El KGD se detectó en la fracción sobrenadante. La detección de la proteína KGD en el pellet se debió a variaciones de los parámetros de sonicación que afectaron a la formación de SMP.
Después del tratamiento con carbonato de sodio, el KGD y la fracción SMP se solubilizaron y se encontraron en la fracción sobrenadante. El perfil de Western Blot prx1 sugirió una asociación con la periferia de la membrana. Para el éxito del protocolo de fraccionamiento submitochondrial, es importante detener la actividad de la proteinasa K después de la hinchazón hipotónica agregando PMSF a las muestras.
Los sitios proporcionan información sobre la localización de la proteína submitochondrial. Este protocolo también se puede utilizar para comprobar la integridad de las preparaciones mitocondriales, lo cual es fundamental durante los estudios proteómicos de los subcompartimentos mitocondriales.
