La información estructural sobre cómo las enzimas de reparación por escisión de bases eliminan las lesiones de ADN en el contexto de la cromatina ha sido escasa. Esto constituye una brecha significativa en nuestra comprensión de los mecanismos involucrados en la etiología de las enfermedades humanas. La principal ventaja de nuestro protocolo es que hemos optimizado la preparación de muestras utilizando equipos de laboratorio estándar.
Esto permitirá a otros bioquímicos en el campo complementar su trabajo bioquímico con estudios crio-EM técnicamente factibles. Nuestro protocolo también se puede utilizar para investigar cómo otros factores, incluidos los factores de transcripción pioneros, interactúan con el nucleosoma. Se trata de un ámbito en el que la información estructural también ha sido limitada.
Optimizar la preparación de la muestra antes de pasar a las condiciones de congelación fue clave para avanzar en nuestro proyecto, y esto se hace mejor con ensayos bioquímicos estándar en el diseño del sustrato, la unión y las condiciones de reticulación. Para comenzar, incube el NCP y el factor de reparación del ADN de interés en hielo durante 15 minutos utilizando un tampón óptimo para el complejo específico. Luego, agregue glutaraldehído a una concentración final de 0.005%Después de mezclarlo bien, incubar a temperatura ambiente durante 13 minutos.
Enfriar con un molar Tris-CL hasta una concentración final de 20 milimolares Tris-CL con pH 7.5. Luego, concéntrese en aproximadamente 50 microlitros e intercambie el tampón con el tampón de congelación utilizando una columna de desalinización. A continuación, determine las absorbancias a una densidad óptica de 280 y 260 nanómetros y concéntrese aún más si es necesario para alcanzar de 1,3 a 3 miligramos por mililitro en función de la densidad óptica de 280 nanómetros.
Después de preparar el botón de diálisis, coloque el botón que contiene la muestra sobre un lecho de polietilenglicol con la membrana hacia abajo. Para realizar la purificación por cromatografía de exclusión de tamaño, lavar y equilibrar una columna de exclusión de tamaño con 60 mililitros de agua destilada, seguido de 80 mililitros de tampón de congelación durante la noche a una velocidad de 0,4 mililitros por minuto. Luego, analice inmediatamente las fracciones pico y concentre aquellas fracciones que contengan la proteína de infusión de histonas MBP-PolBeta-APE1.
Demostrando los siguientes procedimientos estará Elizabeth Viverette, una aprendiz de post-bachillerato del núcleo crio-EM aquí en NIH. Después de encender el congelador de inmersión y llenar el humidificador con 50 mililitros de agua destilada, ajuste la temperatura de la cámara a 22 grados centígrados y la humedad al 98% Luego coloque la taza de etano y la taza de nitrógeno líquido en los respectivos soportes de espacio. Luego, cubra la taza de etano con el dispensador de tapa de etano y vierta cuidadosamente nitrógeno líquido sobre ella mientras llena la taza de nitrógeno con nitrógeno líquido.
Cuando el nivel de nitrógeno líquido se haya estabilizado y alcance el 100% y la temperatura alcance menos 180 grados centígrados, abra con cuidado la válvula de etano y llene la taza de etano hasta que forme una burbuja en la tapa transparente. A continuación, retire el dispensador de etano. Coloque dos papeles de filtro en el dispositivo secante y asegúrelos con un anillo de metal.
Vaya a la configuración y establezca los parámetros de borrado como se describe en el manuscrito, luego seleccione A-Plunge y haga clic en Aceptar. En la pantalla principal, haga clic en Cargar pinzas y cárguelas con una cuadrícula con el lado de aplicación de carbono mirando hacia la izquierda. Calibre las pinzas, ajustando el eje Z para asegurar una mancha sólida. Haga clic en Cámara inferior y aplique tres microlitros del complejo.
Luego haga clic en Blot A-Plunge, que girará la cuadrícula para secar desde el frente y la sumergirá. Después de la transferencia, guarde la rejilla en la caja de rejilla en la cámara de nitrógeno líquido. Cuando las cuatro rejillas se hayan congelado y colocado en la caja de rejilla, gire la tapa a una posición neutra donde todas las rejillas estén cubiertas por la tapa y apriete el tornillo.
Antes de cargar las muestras en el microscopio, coloque las rejillas vitrificadas en un anillo y asegúrelo con un clip en C bajo nitrógeno líquido en una habitación con humedad controlada para evitar la contaminación del hielo. Al cargar el microscopio, inserte las rejillas en un casete de 12 ranuras. Baraja el casete en una cápsula nanocab y cárgalo en el cargador automático.
Luego, transfiera la rejilla del casete a la etapa de microscopio. Ajuste el escenario a la altura eucéntrica tambaleando el escenario 10 grados y moviendo simultáneamente la altura Z hasta que se observe un desplazamiento plano mínimo en las imágenes. Una vez que se alcanza la altura eucéntrica, comience a tomar una imagen de montaje de 3 por 3 de la cuadrícula en la que cada montaje se toma con un aumento de 62x para obtener el atlas.
Después de elegir tres cuadrados de diferentes tamaños y tomar la altura eucéntrica, imagen con un aumento de 210x. Una vez que se toma una imagen de un cuadrado, elija un agujero desde el borde, el centro y el medio dentro de los cuadrados. Luego, cree una imagen de cada agujero con un aumento de 2, 600x.
Tome la imagen de gran aumento desde el centro del orificio con un aumento de 36, 000x y un tiempo de exposición de 7.1 segundos, 60 cuadros, tamaño de 1.18 píxeles y desenfoque de tres micrómetros. Ver imágenes representativas de la proyección. Para determinar la relación de NCP a MBP-PolBeta-APE1 para formar complejos estables, se realizaron ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética, que mostraron una banda desplazada individualmente de la NCP con un exceso molar cinco veces mayor de MBP-PolBeta-APE1.
En menor volumen, el ensamblaje del complejo de NCP-PolBeta-APE1 demostró que la muestra estaba demasiado reticulada y dio lugar a agregados sin complejos individuales discernibles. Sin embargo, la dilución diez veces mayor en los NCP dio como resultado una agregación significativamente reducida y una mejor estabilidad de las partículas. Los métodos de gel preparativo y exclusión de tamaño pueden combinarse cuando el gel preparativo mejora la calidad de los NCP cuando contienen una cantidad significativa de agregados de alto peso molecular, seguido de la purificación del complejo mediante exclusión de tamaño.
Los resultados muestran que ambos métodos se pueden utilizar de forma independiente para generar complejos estables. Además, los datos recopilados de ambas cuadrículas muestran clases bidimensionales casi idénticas y mapas tridimensionales con una resolución de aproximadamente 3,2 angstrom. Primero se debe determinar una proporción óptima de NCP a factor de reparación del ADN, luego la reticulación del complejo con glutaraldehído debe realizarse al menos 10 veces más diluido que la concentración necesaria para la congelación.
Después de obtener un mapa 3D crio-EM del complejo, se necesitará un mayor refinamiento estructural para determinar cómo se encuentra el factor de reparación del ADN e identificar qué regiones son importantes para estas interacciones.
