Este protocolo permite a los investigadores calentar con precisión una bicapa de interfaz de gotas, o DIB, modelo de membrana, lo que permite estudiar una variedad de efectos relacionados con la temperatura que ocurren en entornos celulares. La ventaja principal se deriva de la capacidad de medir y controlar localmente la temperatura del baño en un depósito de bajo volumen sin obstruir el acceso para las caracterizaciones eléctricas u ópticas del DIB. La capacidad de calentar con precisión el baño de fluidos abre la posibilidad de estudiar las propiedades de transporte y señalización en dibs formados a partir de una variedad mucho más amplia de componentes de membrana, incluyendo extractos celulares naturales.
Este es un protocolo de varios pasos que aprovecha múltiples equipos que deben seguirse de cerca para lograr suficiente precisión experimental, por lo que cualquier ambigüedad en el proceso escrito se puede aclarar a través de la demostración visual. Para comenzar, reúna dos piezas de caucho aislante de un milímetro de espesor recortadas a 25 por 40 milímetros de longitud, dos piezas de una goma de seis milímetros de espesor que también son de 25 por 40 milímetros, un conjunto de accesorios de base de aluminio preparados y un depósito de aceite acrílico que cabe en la ventana de visualización del accesorio de base de aluminio. Coloque las piezas de goma más delgadas en la etapa del microscopio de tal manera que el borde largo de cada pieza sea tangencial a la abertura de la etapa.
Coloque el accesorio de base de aluminio en la parte superior de las almohadillas aislantes con la ventana de visualización del accesorio centrada sobre la lente objetivo. Coloque una pieza de goma más gruesa en la parte superior de cada elemento de calentamiento resistivo, luego use un clip de etapa de microscopio para mantenerlo en su lugar para proteger los elementos de calefacción de los daños causados por los clips de la etapa y para aislar contra el cortocircuito eléctrico accidental. Doble cuidadosamente el extremo de medición de un termopar para lograr un ángulo de 90 grados a unos cuatro milímetros del extremo.
Inserte la punta doblada del termopar en la esquina inferior izquierda del accesorio de aluminio y alíquelo suavemente con un tornillo de bloqueo. Coloque el depósito de acrílico en el pozo del accesorio de aluminio antes de agregar aceite de hexadecano al pozo del accesorio de aluminio para minimizar el riesgo de atrapar burbujas de aire entre la ventana de visualización y la parte inferior del depósito de acrílico. Dispense alrededor de 1, 000 microlitros de aceite de hexadecano en el pozo del accesorio de aluminio para proporcionar un área de superficie máxima para que se produzca la transferencia de calor, sin permitir que el aceite se derrame sobre los bordes del accesorio en la etapa del microscopio o la lente objetiva.
Dispense alrededor de 1,000 microlitros de aceite de hexadecano en el depósito de acrílico sin llenarlo en exceso. Mida la capacitancia nominal de la membrana mientras reduce la temperatura del baño de aceite desde un punto de ajuste que permita la formación de bicapas para identificar las transiciones de fase termotrópicas de los lípidos en la membrana. Haga clic con el botón derecho en el gráfico de temperatura de la GUI y borre los datos de visualización para asegurarse de que hay suficiente espacio disponible en el búfer para grabaciones posteriores.
Utilizando el generador de forma de onda conectado al amplificador de abrazadera de parche, aplique una forma de onda de voltaje triangular a través de los electrodos de la interfaz de gota, o DIB, y registre la respuesta de corriente inducida a través de la bicapa. Enfríe la bicapa reduciendo la temperatura del punto de ajuste en incrementos de cinco grados, esperando un mínimo de cinco minutos a la nueva temperatura de estado estacionario entre los cambios de temperatura hasta que se logre la temperatura deseada. Después del baño de aceite y enfriar la bicapa a la temperatura mínima deseada, haga clic con el botón derecho en el gráfico de temperatura en la GUI nuevamente y exporte los datos de temperatura versus tiempo a un software de hoja de cálculo.
Detenga la grabación actual. A partir de la corriente medida, calcule la capacitancia nominal de la respuesta de la corriente de onda cuadrada en comparación con el tiempo durante el período de enfriamiento. Trace la capacitancia nominal versus la temperatura para observar cómo cambió la capacitancia de la membrana, luego localice los cambios no monótonos en la capacitancia versus la temperatura para identificar la temperatura de fusión.
Del mismo modo, evalúe la capacitancia cuasi estática específica de la bicapa a temperaturas fijas incrementando sucesivamente la temperatura del baño de aceite y el área de la bicapa. Cambie la temperatura del punto de ajuste en incrementos de 10 grados Celsius utilizando la GUI y permita que el sistema se equilibre con la nueva temperatura. Realice los pasos previamente descritos para iniciar la medida de la corriente capacitiva y de la grabación.
Cambie el área de la bicapa ajustando cuidadosamente las posiciones de los electrodos utilizando los micro manipuladores. Permita que la corriente de onda cuadrada alcance una amplitud de estado estacionario y recopile imágenes del DIB para permitir el cálculo del área de la membrana frente al tiempo. Utilice una cámara montada en el microscopio para obtener imágenes de la bicapa como se ve desde la apertura.
Agregue simultáneamente una etiqueta digital al software de grabación actual para marcar el punto de tiempo correspondiente para la recopilación de imágenes. Obtenga un total de cinco imágenes DIB y regiones de estado estacionario de corriente bicapa, luego restablezca la temperatura y repita la imagen. Analice las grabaciones actuales y las imágenes DIB en los puntos de tiempo etiquetados correspondientes a las áreas bicapa de estado estacionario, extraiga la capacitancia bicapa y el área para cada temperatura.
Trace la capacitancia versus el área para cada temperatura y calcule la pendiente de la regresión de primer orden, que representa la capacitancia específica de la bicapa en cada temperatura. A continuación, trace los valores de capacitancia específica frente a sus respectivas temperaturas. Examine los datos de capacitancia específica frente a los datos de temperatura en busca de variaciones no monotónicas para identificar las temperaturas de fusión.
Evalúe la dinámica de la formación de canales iónicos dependientes del voltaje generando una entrada de paso de voltaje de CC a través de la bicapa. Establezca el voltaje inicial en el valor de paso deseado en milivoltios y el voltaje final y el tamaño del paso en un valor superior al paso deseado. Establezca un tiempo de duración deseado para la entrada de paso en segundos y, a continuación, elija la polaridad deseada para la entrada de paso.
Cambie el amplificador de abrazadera de parche para enviar el voltaje de comando que se origina desde la vista de laboratorio o el módulo de salida de voltaje a la etapa de la cabeza, encienda el voltaje y registre la respuesta de corriente inducida, que debería inhibir una respuesta en forma de S a un voltaje crítico. Obtenga por separado relaciones dinámicas de voltaje de corriente para una membrana a las temperaturas deseadas para revelar relaciones dependientes de voltaje, como los comportamientos del canal iónico. Cambie el amplificador de abrazadera de parche para enviar el voltaje de comando que se origina desde el generador de forma de onda a la etapa de la cabeza e inicie las grabaciones de corriente.
En el generador de forma de onda, genere una forma de onda sinusoidal continua con una amplitud, desplazamiento y frecuencia deseados. Registre la respuesta de corriente inducida a través de uno o varios ciclos y repita como desee para diferentes amplitudes de onda sinusoidal, frecuencias y temperaturas. El sistema de control de temperatura se utilizó para mostrar la dependencia de la temperatura de un DIB formado a partir de extracto de lípidos totales del cerebro, o BTLE, lípidos.
Las mediciones de la corriente capacitiva y la temperatura frente al tiempo se muestran durante un ciclo de calentamiento desde la temperatura ambiente hasta aproximadamente 60 grados Centígrados. Se documentaron cambios en la capacitancia nominal versus la temperatura a lo largo de un ciclo completo de enfriamiento/calentamiento, después de la formación inicial de bicapa a 60 grados Celsius. Las mediciones cuasiestáticas de capacitancia específica a diferentes temperaturas se pueden utilizar para identificar la temperatura de fusión de lípidos.
Trazar la capacitancia de un área de bicapa versus bicapa permite una regresión lineal, donde la pendiente representa el valor de capacitancia específica. La imagen DIB muestra que, cuando la temperatura está por debajo de la temperatura de fusión, la membrana adopta un estado altamente adhesivo, incluso bajo la tensión de gotitas estiradas causadas por electrodos bien separados. Las trazas de corriente versus voltaje mostradas se obtuvieron mediante la aplicación de tensiones de membrana sinusoidales, midiendo la corriente inducida a dos temperaturas diferentes.
Las flechas y los números subsiguientes ayudan a visualizar los cuartos sucesivos del voltaje sinusoidal con respecto al tiempo. La densidad de corriente medida para una membrana BTLE dopada con monazomicina al mismo nivel de voltaje y dos temperaturas diferentes se muestra aquí. Es crucial dispensar el aceite de hexadecano en el pozo del accesorio de aluminio correctamente.
Si esto se hace fuera de secuencia o no con cuidado, se formarán burbujas de aire debajo del pozo de acrílico, lo que obstruirá la vista de abajo hacia arriba del DIB. El usuario también debe recordar borrar el búfer de datos en el software de control de temperatura antes de cada medición para garantizar un registro completo. Este procedimiento permite caracterizar las membranas biomiméticas a través de un rango de temperaturas, que es necesario para estudiar la dependencia de la temperatura de la estructura de la membrana y el transporte.
Además, esta capacidad podría utilizarse para revelar los efectos a nanoescala de otras especies activas en la membrana, como los canales iónicos biológicos y los nanomateriales de ingeniería.
