Agradecemos a Laurent Limozin, Pierre Dillard y Astrid Wahl para continuar un debate fructífero sobre aplicaciones celulares. Agradecemos también a Frederic Bedu desde las instalaciones de sala limpia PLANETE por su ayuda con las observaciones de SEM. Este trabajo fue financiado en parte por el Consejo Europeo de Investigación a través de la subvención Nº 307104 FP / 2007-2013 / CEI.

1. limpieza de vidrio Cover-toboganes y cámaras de observación <ol><li> Organizar el vidrio de cubierta-se desliza sobre una bandeja de múltiples de cremallera realizado en un material inerte como politetrafluoroetileno (PTFE). </li><li> Sumergir la bandeja con toboganes y la cámara de observación en una solución de tensioactivo (cualquier producto recomendado para la limpieza de cubetas de cuarzo es adecuado). </li><li> El uso de un baño ultrasónico, ultra-sonicado en la solución de tensioactivo durante 30 min a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° C). </li><li> Enjuagar 5 veces con agua ultrapura (18,2 MΩ.cm, 0,059 S / cm). </li><li> Ultra-sonicado en solución de tensioactivo durante 30 min a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° C). </li><li> Enjuague 10 veces con agua ultrapura. </li><li> Repetir los pasos 1.5 y 1.6 dos veces. </li><li> Tienda en agua a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° C) durante hasta una semana. </li></ol> 2. La fabricación de proteínas Nano-puntos <ol><li> La deposición de perlas <ol><li> Deposit la suspensión de perlas de sílice (2% v / v, 70 l) gota a gota en una cubierta de corredera (24 x 24 mm, espesor de 170 micras) mantenidos a una inclinación de 15 grados. </li><li> Deje que la suspensión se extendió durante aproximadamente 1 min, mientras que dar la vuelta al vidrio de 90 ° cada 15 s. </li><li> Permitir que el líquido se evapore en condiciones ambientales. </li><li> Almacenar en un vidrio limpio o cámara de PTFE en condiciones ambientales durante hasta 2 días. </li></ol></li><li> La deposición de aluminio <ol><li> Colocar los portaobjetos (preparado en la sección 2.1) dentro de una frecuencia de radio magnetrón (RF) equipo de pulverización catódica 8, sobre una mesa que gira a una distancia de aproximadamente 105 mm a partir de una aleación de aluminio (99%): silicio (1%) de destino. </li><li> Bomba abajo de la cámara de deposición a 2,6 x 10 -4 Pa utilizando una bomba turbo-molecular. Este paso es importante para la eliminación de posibles impurezas gaseosas. </li><li> Introducir pura atmósfera de argón (5 N, 99,999%) con un flujo de 10 sccm a una presión de 0,8 Pa (6,6 mTorr). <br/&gt; NOTA: El flujo de argón entrante está controlado por un controlador de flujo másico y la presión del proceso se monitoriza utilizando un medidor de presión. El flujo de gas argón es continua y es controlado por un equilibrio entre la entrada y las válvulas de abertura de salida. </li><li> Encender el generador de potencia de RF. NOTA: En este caso, se utilizó un rango típico de 400-600 W de potencia de radiofrecuencia a 13,56 MHz de frecuencia. El generador de RF se utiliza con una red de adaptación en un modo de acoplamiento de plasma capacitivo. La potencia reflejada se supervisa y se reduce al mínimo el uso de la adaptación de la red. </li><li> Después se estabiliza el plasma, por pulverización catódica durante 2 minutos manteniendo el obturador cerrado para eliminar posibles impurezas de la superficie del objetivo. </li><li> Abra el obturador y permitir la pulverización catódica para continuar durante 60 min para depositar aluminio sobre el portaobjetos de vidrio hasta un espesor de 200 nm. </li><li> Cortar el flujo de argón, cerrar la válvula de compuerta para aislar la bomba turbomolecular de la cámara de deposición y ventilar la cámara con limpio nitrogen para obtener la presión ambiente. Recuperar los portaobjetos de aluminio recubiertos. Almacenar durante un máximo de un mes en una caja de vidrio o PTFE limpio y herméticamente cerrado en condiciones ambientales. </li></ol></li><li> deposición de vapor de organosilano <ol><li> Sumergir el portaobjetos recubierto de aluminio preparado en la etapa 2.2.6 en agua ultrapura a temperatura ambiente y ultra-sonicado durante 30 s en un baño ultrasónico (50 W, 50/60 Hz, entre 20 y 30 ° C). </li><li> Depósito de 0,5 ml de (3-aminopropil) trietoxisilano (APTES) en la parte inferior de un desecador. PRECAUCIÓN: APTES es un organosilano, que se evapora fácilmente y es tóxico. APTES deberán ser manejados solamente bajo una campana de flujo y con guantes. </li><li> Poner los portaobjetos de vidrio (preparado en 2.3.1) en una cuadrícula de cerámica y el lugar en el interior del desecador. </li><li> Conectar el desecador a una bomba de membrana y correr a la máxima potencia durante 30 min para generar un vacío bajo. </li><li> Cierre la válvula del desecador y apagar la bomba. </li><li> Calentar el desecadora aproximadamente 50 ° C durante 1 h. </li><li> Abrir el desecador y recoger las diapositivas. </li><li> Transferencia a otro desecador limpio para almacenamiento de hasta 48 h a temperatura ambiente (20 a 30 ° C). </li></ol></li><li> La deposición de la primera capa de proteína - albúmina de suero bovino marcado con biotina (BSA-biotina) <ol><li> Coloque una de las diapositivas preparadas en el apartado 2.3 sobre un soporte de PTFE. </li><li> Depósito de 1 ml de 25 mg / ml de BSA-biotina disuelto en tampón fosfato salino (PBS). Dejar durante 30 min a temperatura ambiente (20 a 30 ° C). </li><li> Enjuague 10 veces con PBS. Almacenar la muestra para un máximo de 24 horas a 4 ° C lejos de la fuente de luz. </li></ol></li><li> La eliminación de máscara de aluminio <ol><li> Incubar los portaobjetos en una solución de NaOH en PBS (preparado por adición gota a gota de NaOH 1 M a aproximadamente 100 ml de PBS para obtener pH≈12) durante la noche a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° C). PRECAUCIÓN. NaOH es corrosivo y debe ser manejado usando guantes. </li><li> Enjuague10 veces en agua ultrapura. </li></ol></li></ol> 3. Deposición de Apoyado bicapa lipídica (SLB) <ol><li> La limpieza de la artesa de Langmuir <ol><li> Eliminar el agua en el recinto de PTFE de la artesa de Langmuir usando una bomba. </li><li> Limpiar con una toalla desechable no tejido sin pelusa humedecido en cloroformo. PRECAUCIÓN. El cloroformo es tóxico y debe ser manipulada en un área bien ventilada, con una máscara (o bajo una campana de flujo) y con los guantes apropiados. </li><li> Limpio 4 veces con agua ultrapura tibia (40 a 50 ° C). </li><li> Limpias al menos 6 veces con agua ultrapura frío. </li></ol></li><li> La deposición de la primera capa de lípidos <ol><li> Colocar bandejas de PTFE en el recinto de PTFE de la artesa de Langmuir y luego llenarlo con agua ultrapura. </li><li> Utilice el software de control del aparato de Langmuir para ajustar la presión medida a 0 mN / m. </li><li> Usar una jeringa de vidrio impermeable a los gases / metal para depositar 30 l de una solución de lípidos 1 mg / mL (1, 2-dioleoil sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) en cloroformo) en la superficie del agua. El cloroformo se evapora y las moléculas lipídicas forman espontáneamente una monocapa. </li><li> Utilice el software de control para comprimir la monocapa lipídica mediante el cierre de la barrera de PTFE hasta la presión deseada (27 mN / m para DOPC) se alcanza. </li><li> Utilice el software de control para sumergir el portaobjetos de vidrio preparado en la sección 2.5.2 en el recinto PTFE mediante una abrazadera motorizado. </li><li> Mantenga la corredera, en la abrazadera, perpendicular a la interfaz aire-agua. Utilice el software de control para aumentar lentamente (15 mm / min) a través de la interfaz, mientras que el mantenimiento de una presión constante a 27 mN / m. </li><li> Colocar en un ambiente seco, ya sea para uso inmediato o para el almacenamiento de hasta 24 h a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° C). </li></ol></li><li> La deposición de la segunda capa lipídica <ol><li> Mantener la presión de la superficie en la cubeta de Langmuir en el valor deseado de 27 mN / m. Comprimir usando elsoftware de control del aparato de Langmuir y / o añadir una pequeña cantidad de lípido para alcanzar la presión deseada. </li><li> Colocar los portaobjetos de vidrio que llevan la monocapa lipídica, preparada en la sección 3.2.6, horizontalmente en la superficie del agua. Asegúrese de que cada corredera está flotando por encima de una bandeja de PTFE. </li><li> Empuje los portaobjetos de vidrio hacia abajo, una diapositiva a la vez, en su bandeja de PTFE correspondiente usando PTFE o de metal pinzas de tal manera que se sumergen en el agua. Evite inclinar las diapositivas mientras empuja. </li><li> Utilizar PTFE o de metal pinzas para transferir las bandejas que contienen PTFE las diapositivas en un cristalizador lleno de agua ultrapura asegurándose de que las diapositivas no se exponen al aire. </li><li> Utilice PTFE o de metal pinzas para transferir, durante el trabajo bajo el agua, un portaobjetos de vidrio recubiertos con bicapa en una cámara de observación. NOTA: La cámara de observación se coloca bajo el agua en el interior del cristalizador. La cámara de observación se hace y se compone de un anillo de PTFE con una una junta de goma de encargocarcasas de acero D, que se pueden montar bajo el agua para hacer una cámara estanca al agua, cuya superficie inferior está hecho de la placa de vidrio previamente revestida con la bicapa lipídica. </li><li> Cerrar la cámara sin dejar de trabajar bajo el agua y asegurar que aproximadamente 1 ml de agua queda atrapada dentro de la cámara. </li><li> Tomar la cámara ensamblada fuera del agua. Asegúrese de que está libre apretado de agua y las fugas. </li><li> Reemplazar las 1 ml de agua ultrapura presente en la cámara de observación con PBS mediante la adición y la eliminación de 500 l de PBS 10 veces. Asegúrese de que la cámara nunca es desprovisto de líquido. </li></ol></li><li> SLB etapa de bloqueo <ol><li> Introducir 100 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA) en la cámara de observación que contiene el portaobjetos preparado en el apartado 3.3.6 y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° C). </li><li> Enjuague la bicapa mediante la eliminación y la adición de 500 l de PBS 10 veces. La bicapa puede ser mantenido 24 horas a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 4. La funcionalización con ligandos <ol><li> Añadir fluorescente o neutravidina no fluorescente (NAV, una versión desglicosilada de la avidina no cargado a pH 7) a 2 mg / ml en la cámara que contiene el portaobjetos preparado en el apartado 3.4.2 durante 30 min a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° DO). </li><li> Enjuague mediante la adición y la eliminación de 500 l de PBS 10 veces. </li><li> Añadir biotinilado anti-CD3 a 2 mg / ml a la cámara que contiene el portaobjetos preparado en el apartado 3.4.2. Para doble funcionalización del SLB y los puntos, añadir Fc-ICAM-1 His-tag en 5 mg / ml (aquí, la bicapa está hecho de DOPC + 1% de lípidos de ácido nitrilotriacético (NTA)). Dejar durante 30 min a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° C). </li><li> Enjuague mediante la adición y la eliminación de 500 l de PBS 10 veces </li><li> Sustituir el PBS con medio celular (PBS + BSA al 0,1%) mediante la adición y la eliminación de 500 l de medio celular 10 veces. </li><li> Deja 200 l de medio celular en el chambeR con la diapositiva. </li><li> Coloque la cámara durante 10 min a 37 ° C antes de añadir las células. </li></ol> 5. deposición de células (véase la referencia 7 para más detalles) <ol><li> depositar cuidadosamente 400! l de la suspensión celular en la cámara. Se incuban las células durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Fijar la célula con 2% de paraformaldehído (PFA) durante 15 min a 37 ° C. Sustituir el PFA con PBS mediante la eliminación y la adición de 500 l de PBS repetido. </li></ol> 6. Observación <ol><li> Proteo-lipídica Nano-patrón y fluidez SLB <ol><li> Utilice un microscopio de fluorescencia a la imagen del patrón de proteínas en el modo de epi-fluorescencia utilizando longitud de onda apropiada de iluminación (639 nm) y cubos de filtro (por ejemplo, aquí, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688). NOTA: La intensidad de la señal se puede cuantificar para estimar la cantidad de proteína dentro y fuera del punto. Utilice una longitud de onda apropiada de iluminación (330 nm) y fcubo ILTER a la imagen de la bicapa (BP 365/12, FT 395, LP 397), que aparece brillante con agujeros oscuros. </li><li> Utilice fotoblanqueo continua (CPB) técnica 13, 15 para medir la constante de difusión de los lípidos de trazador en la bicapa. Esta observación se hace preferiblemente justo después de la deposición SLB. NOTA: Para cuantificar la constante de difusión, se miden dos parámetros durante el proceso de CPB: el tiempo de blanqueo específica del colorante (tensa) y la longitud de decaimiento del perfil fluorescente del halo formado alrededor del área blanqueada (TAUD). El primero se obtiene mediante el trazado de la evolución temporal de la intensidad de fluorescencia en el centro del campo iluminado durante el proceso de CPB. El segundo se obtiene representando el perfil de intensidad en el borde de la zona iluminada (promediado sobre 12 líneas y 5 imágenes después de que se alcanza el estado estacionario). Las curvas se ajustaron a obtener tensa y TAUD. La constante de difusión viene dada por tauD 2 / tensa (D = <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/55060/55060eq1.jpg" /> ). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22">Molecular Biology of the Cell</a>. , 4th edition, Garland Science. New York. (2002).</li>
<li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cell+Receptor-Proximal+Signals+Are+Sustained+in+Peripheral+Microclusters+and+Terminated+in+the+Central+Supramolecular+Activation+Cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster.</a> Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).</li>
<li>Kaizuka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+segregating+T+cell+receptor+and+adhesion+molecules+during+immunological+synapse+formation+in+Jurkat+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).</li>
<li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li>
<li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell-antigen+recognition+and+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">T-cell-antigen recognition and the immunological synapse.</a> Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immunological+Synapse%3A+A+Molecular+Machine+Controlling+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation.</a> Science. 285, 221-228 (1999).</li>
<li>Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-mediated+friction+determines+morphodynamics+of+spreading+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells.</a> Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).</li>
<li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+viral+antigen+processing+generates+peptide-specific+MHC+class+I+cell-surface+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).</li>
<li>Pi, F., Dillard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-Tunable+Organic+Nanodot+Arrays%3A+A+Versatile+Platform+for+Manipulating+and+Imaging+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells.</a> Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).</li>
<li>Deeg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+activation+is+determined+by+the+number+of+presented+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">T cell activation is determined by the number of presented antigens.</a> Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).</li>
<li>Delcassian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+ligand+spacing+influences+receptor+triggering+in+T+cells+and+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells.</a> Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).</li>
<li>Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+and+efficient+T+cell+activation+with+stimulatory+aCD3+nanoarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays.</a> Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).</li>
<li>Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-clustering+of+ligands+on+surrogate+antigen+presenting+cells+modulates+T+cell+membrane+adhesion+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization.</a> Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).</li>
<li>Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometric+protein-patch+arrays+on+glass+and+polydimethylsiloxane+for+cell+adhesion+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+lett%22%5BJournal%5D)">Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies.</a> Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).</li>
<li>Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+and+intermembrane+distance%3A+case+study+of+avidin+and+E-cadherin+mediated+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion.</a> Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).</li>
<li>Sengupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/la026146o">Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid.</a> Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).</li>
<li>Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independently+controlling+protein+dot+size+and+spacing+in+particle+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography.</a> Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).</li>
<li>Massou, S., et al. <a target="_blank" href="http://adsabs.harvard.edu/abs/2009ApSS..256..395M">Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates.</a> Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).</li>
<li>Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperativity+in+adhesion+cluster+formation+during+initial+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion.</a> Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).</li>
<li>Arnold, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cell+polarization+and+migration+by+a+gradient+of+nanoscale+variations+in+adhesive+ligand+spacing%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing.</a> Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).</li>
<li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+spreading+and+focal+adhesion+dynamics+are+regulated+by+spacing+of+integrin+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands.</a> Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li>
<li>Schvartzman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanolithographic+Control+of+the+Spatial+Organization+of+Cellular+Adhesion+Receptors+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level.</a> Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).</li>
<li>Mossman, K., Groves, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+supported+membranes+as+tools+for+quantitative+studies+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.Soc.Rev%22%5BJournal%5D)">Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse.</a> Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).</li>
<li>Furlan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+CD45+both+positively+and+negatively+regulates+T+cell+receptor+phosphorylation+in+reconstituted+membrane+protein+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters.</a> J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).</li>
<li>Hsu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+mobility+modulates+immunological+synapse+formation+and+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation.</a> PloS One. 7 (2), e32398(2012).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+integrin+binding+to+Arg-Gly-Asp+peptide+activates+actin+polymerization+and+contractile+movement+that+stimulates+outward+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los pasos críticos en el protocolo descrito anteriormente se relacionan con la formación de la proteína nano-puntos o la parte posterior de llenado del espacio alrededor de los puntos por una bicapa de lípidos compatible. El primer paso crítico con respecto a la proteína de nano-puntos es la preparación de la perla-máscara. La limpieza de la cubierta de corredera es crítica. Los portaobjetos necesitan ser limpiados o bien con una solución de detergente que se recomienda para la limpieza de cubetas de cuarzo, o...

<html> La adhesión celular se lleva a cabo a través de moléculas especializadas de adhesión celular (CAMs), las proteínas presentes en la membrana celular que son capaces de unirse a su contraparte en la matriz extracelular o en otra célula. En células adheridas, la mayoría de las moléculas de adhesión, incluyendo la integrina ubicua y cadherina, se encuentran en la forma de los grupos 1. La interacción de los linfocitos T (células T) con células presentadoras de antígeno (APCs) proporciona una ilustración particularmente notable de la importancia de grupos de receptores formados en la interfaz entre las dos células - menudo se llama una sinapsis inmunológica. Tras la formación de la primera contacto con los receptores de las células APC, T (TCR) en la superficie del encofrado de celdillas micras racimos escala T que sirven como señalización de las plataformas 2, 3, 4, y son finalmente centralizado para formar un clúster supramolecular central más grande (cSMAC )lass = &quot;xref&quot;&gt; 5, 6, 7. Recientemente, se demostró que en el lado de APC, los ligandos de la TCR también se agrupan 8. En el contexto de la interacción de células T-APC, el despliegue de sistemas híbridos, en el que el APC es imitado por una superficie artificial funcionalizado con proteínas relevantes, se ha avanzado en gran medida nuestra comprensión de la interfaz sináptica 2, 3, 4, 5, 6, 7 . En este contexto, es muy relevante para diseñar APC superficies miméticas que capturan uno o más aspectos de la célula diana. Por ejemplo, si los ligandos se injertan en bicapas lipídicas compatibles, que pueden difundirse en el plano de la bicapa, imitar la situación en la superficie de APC y al mismo tiempo permitir la formación de lacSMAC 6, 7. Del mismo modo, los racimos en la APC se han imitado mediante la creación de islas de ligandos en un mar de polímeros 9, 10, 11, 12, 13, 14. Sin embargo, estas dos características hasta ahora no han sido combinados. Aquí se describe una nueva técnica para crear nano-puntos de anti-CD3 (un anticuerpo que se dirige el complejo TCR), rodeada por una bicapa lipídica con lípidos que se difunden. La bicapa se deposita usando Langmuir-Blodgett / Langmuir-Schaefer técnica 7, 15, 16 y si se desea, podría ser funcionalizada con una proteína específica - por ejemplo, el ligando de la integrina de células T (llamado ICAM1). Además, el anti-CD3 puntos de proteínas COUld ser reemplazado con otro anticuerpo o CAM. Si bien hemos elegido las proteínas para uso futuro como plataforma para los estudios de adhesión de células T, la estrategia se detalla aquí se puede adaptar para cualquier proteína e incluso ADN.

<table><tbody><tr><td>Glass coverslips</td><td>Assistent, Karl Hecht KG&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Observation chamber</td><td>Home made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex)</td><td>Hella Analytics</td><td>9-307-011-4-507</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-sonicator</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Labbox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystallizer&amp;nbsp;</td><td>Shott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutravidine</td><td>Thermo Fischer Scientifique</td><td>84607</td><td></td></tr><tr><td>PBS&amp;nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Water MQ&amp;nbsp;</td><td>ELGA, Veolia France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silica beads</td><td>Corpuscular Inc</td><td>147114-10</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Biotin</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Dansyl-PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810330C</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-aldrich</td><td>650471</td><td></td></tr><tr><td>Gastight syringe&amp;nbsp;</td><td>Dominique Dustcher , France</td><td>74453</td><td></td></tr><tr><td>Film balance</td><td>NIMA</td><td>Medium</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss, Germany</td><td>TIRF-III system</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium Target&amp;nbsp;</td><td>Kurt J. Lesker Compagny, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Radio Frequency Magnetron sputtering Syst&amp;egrave;me&amp;nbsp;</td><td>modified SMC 600 tool by ALCATEL , France</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ligand nano-cluster arrays in a supported lipid bilayer

Actualmente existe un gran interés en la creación de matrices ordenadas de islas de proteínas adhesivas en un mar de superficie neutralizada para estudios biológicos celulares. En los últimos años, se ha vuelto cada vez más claro que las células vivas responden, no sólo a la naturaleza bioquímica de las moléculas que se les presentan, sino también a la forma en que se presentan estas moléculas. La creación de proteínas micro-patrones tanto, es ahora estándar en muchos laboratorios de biología; nano-patrones son también más accesible. Sin embargo, en el contexto de interacciones célula-célula, hay una necesidad de patrón no sólo proteínas sino también bicapas lipídicas. Tal patrón de doble proteo-lipídica hasta ahora no ha sido fácil acceso. Ofrecemos una técnica fácil para crear proteínas nano-puntos apoyados sobre vidrio y proponer un método para rellenar el espacio entre puntos con una bicapa lipídica compatible (SLB). Desde foto-blanqueo de trazador lípidos fluorescentes incluyen en la SLB, se demuestra que la bicapa exhibe considerable en-plane fluidez. Funcionalización de los puntos de proteínas con grupos fluorescentes nos permite la imagen de ellos y demostrar que están ordenados en una red hexagonal regular. El tamaño típico de punto es de aproximadamente 800 nm y la separación demostrado aquí es de 2 micras. Se espera que estos sustratos para servir como plataformas útiles para la adhesión celular, la migración y estudios mecano-de detección.

Las imágenes de fluorescencia se analizaron para medir el espaciamiento y tamaño de los puntos. Se encontró espaciamiento Típica ser 1900 ± 80 nm y dot-tamaño típico fue de 600 ± 100 nm (Figura 1g). La separación es fijado por el tamaño de las perlas usadas para la máscara. El tamaño de punto se establece por el cordón de tamaño, así como condiciones de deposición. El SLB se deposita únicamente alrededor de los puntos de proteínas y no en ellos ...

Watch this Scientific Journal Video about Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer at JoVE.com

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Se presenta un protocolo para funcionalizar vidrio con parches de proteínas nanométricas rodeadas por una bicapa lipídica fluida. Estos sustratos son compatibles con el microscopio óptico avanzado y se espera que sirva como plataforma para los estudios de adhesión celular y la migración.

Arrays Ligando Nano-racimo en un Apoyado bicapa lipídica

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

ligand-nano-cluster-arrays-in-a-supported-lipid-bilayer

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.9K vistas.  CNRS, UMR 7325, CINaM.  Se presenta un protocolo para funcionalizar vidrio con parches de proteínas nanométricas rodeadas por una bicapa lipídica fluida. Estos sustratos son compatibles con el microscopio óptico avanzado y se espera que sirva como plataforma para los estudios de adhesión celular y la migración. 

Video: Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Método para visualizar y analizar de membrana Interactuando Proteínas por Microscopía Electrónica de Transmisión

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Investigación

Bioquímica

Facile Preparation of Internally Self-assembled Lipid Particles Stabilized by Carbon Nanotubes

We present a facile method to prepare nanostructured lipid particles stabilized by carbon nanotubes (CNTs). Single-walled (pristine) and multi-walled (functionalized) CNTs are used as stabilizers to produce Pickering type oil-in-water (O/W) emulsions. Lipids namely, Dimodan U and Phytantriol are used as emulsifiers, which in excess water self-assemble into the bicontinuous cubic Pn3m phase. This highly viscous phase is fragmented into smaller particles using a probe ultrasonicator in presence of conventional surfactant stabilizers or CNTs as done here. Initially, the CNTs (powder form) are dispersed in water followed by further ultrasonication with the molten lipid to form the final emulsion. During this process the CNTs get coated with lipid molecules, which in turn are presumed to surround the lipid droplets to form a particulate emulsion that is stable for months. The average size of CNT-stabilized nanostructured lipid particles is in the submicron range, which compares well with the particles stabilized using conventional surfactants. Small angle X-ray scattering data confirms the retention of the original Pn3m cubic phase in the CNT-stabilized lipid dispersions as compared to the pure lipid phase (bulk state). Blue shift and lowering of the intensities in characteristic G and G&#39; bands of CNTs observed in Raman spectroscopy characterize the interaction between CNT surface and lipid molecules. These results suggest that the interactions between the CNTs and lipids are responsible for their mutual stabilization in aqueous solutions. As the concentrations of CNTs employed for stabilization are very low and lipid molecules are able to functionalize the CNTs, the toxicity of CNTs is expected to be insignificant while their biocompatibility is greatly enhanced. Hence the present approach finds a great potential in various biomedical applications, for instance, for developing hybrid nanocarrier systems for the delivery of multiple functional molecules as in combination therapy or polytherapy.

We report on a smart application of carbon nanotubes for kinetic stabilization of lipid particles that contain self-assembled nanostructures in their cores. The preparation of lipid particles requires rather low concentrations of carbon nanotubes permitting their use in biomedical applications such as drug delivery.

Preparación fácil del ensamblado autónomos Internamente Lípidos Las partículas estabilizadas por nanotubos de carbono

We present a facile method to prepare nanostructured lipid particles stabilized by carbon nanotubes (CNTs). Single-walled (pristine) and multi-walled ...

Química

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Formación de biomembrana Microarrays con un método basado en la Asamblea Rasero

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Bioingeniería

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análisis de interacción proteína-proteína de membrana

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

Formación Automated bicapa lipídica membrana utilizando un polidimetilsiloxano Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Self-Assembly of Hybrid Lipid Membranes Doped with Hydrophobic Organic Molecules at the Water/Air Interface

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers can be readily functionalized and have been used in various applications such as bio-sensors and bio-devices. In this study, we introduced a planar organic molecule: copper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) to dope lipid membranes. The CuPc/lipid hybrid membrane forms at the water/air interface by self-assembly. In this membrane, the hydrophobic CuPc molecules are located between the hydrophobic tails of lipid molecules, forming a lipid/CuPc/lipid sandwich structure. Interestingly, an air-stable hybrid lipid bilayer can be readily formed by transferring the hybrid membrane onto a Si substrate. We report a straightforward method for incorporating nanomaterials into a lipid bilayer system, which represents a new methodology for the fabrication of biosensors and biodevices.

We report a protocol for producing a hybrid lipid membrane at the water/air interface by doping the lipid bilayer with copper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) molecules. The resulting hybrid lipid membrane has a lipid/CuPc/lipid sandwich structure. This protocol can also be applied to the formation of other functional nanomaterials.

Autoensamble de membranas lipídicas híbridas dopadas con moléculas orgánicas hidrófobas en la interfaz agua/aire

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown into highly ordered two-dimensional (2D) crystals under favorable conditions. The quality of the grown 2D crystals is crucial to the resolution of the final reconstruction via 2D image processing. Over the years, lipid monolayers have been used as a supporting layer to foster the 2D crystallization of peripheral membrane proteins as well as soluble proteins. This method can also be applied to 2D crystallization of integral membrane proteins but requires more extensive empirical investigation to determine detergent and dialysis conditions to promote partitioning to the monolayer. A lipid monolayer forms at the air-water interface such that the polar lipid head groups remain hydrated in the aqueous phase and the non-polar, acyl chains, tails partition into the air, breaking the surface tension and flattening the water surface. The charged nature or distinctive chemical moieties of the head groups provide affinity for proteins in solution, promoting binding for 2D array formation. A newly formed monolayer with the 2D array can be readily transfer into an electron microscope (EM) on a carbon-coated copper grid used to lift and support the crystalline array. In this work, we describe a lipid monolayer methodology for cryogenic electron microscopic (cryo-EM) imaging.

Lipid monolayers have been used as a foundation for forming two-dimensional (2D) protein crystals for structural studies for decades. They are stable at the air-water interface and can serve as a thin supporting material for electron imaging. Here we present the proven steps on preparing lipid monolayers for biological studies.

Preparación de muestras utilizando un método de monocapa lipídica para estudios cristalográficos de electrones

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It is not only passively generated by cellular activities, but also actively regulates protein interactions and is involved in many intracellular signaling. Thus, it is of great value to examine the role of membrane curvature in regulating the distribution and dynamics of proteins and lipids. Recently, many techniques have been developed to study the relationship between the curved membrane and protein in vitro. Compared to traditional techniques, the newly developed nanobar-supported lipid bilayer (SLB) offers both high-throughput and better accuracy in membrane curvature generation by forming a continuous lipid bilayer on patterned arrays of nanobars with a pre-defined membrane curvature and local flat control. Both the lipid fluidity and protein sensitivity to curved membranes can be quantitatively characterized using fluorescence microscopy imaging. Here, a detailed procedure on how to form a SLB on fabricated glass surfaces containing nanobar arrays&#160;and the characterization of curvature-sensitive proteins on such SLB are introduced. In addition, protocols for nanochip reusing and image processing are covered. Beyond the nanobar-SLB, this protocol is readily applicable to all types of nanostructured glass chips for curvature sensing studies.

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Here, a nanobar-supported lipid bilayer system is developed to provide a synthetic membrane with a defined curvature that enables the characterization of proteins with curvature sensing ability in vitro.

Un sistema de bicapa lipídica soportado por nanobar para el estudio de proteínas de detección de curvatura de membrana in vitro

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

Ensamblaje de modelos de bicapa lipídica soportada y suspendida de imitación celular para el estudio de interacciones moleculares

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Patrón de proteínas reversibles controlado por luz en membranas lipídicas

Dynamic Light-Induced Protein Patterns at Model Membranes

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell polarization, migration, and division. Thus, methods to recruit proteins to model membranes with subcellular resolution and high temporal control are essential when reproducing and controlling such processes in synthetic cells. Here, a method is described for fabricating light-regulated reversible protein patterns at lipid membranes with high spatiotemporal precision. For this purpose, we immobilize the photoswitchable protein iLID (improved light-inducible dimer) on supported lipid bilayers (SLBs) and on the outer membrane of giant unilamellar vesicles (GUVs). Upon local blue light illumination, iLID binds to its partner Nano (wild-type SspB) and allows the recruitment of any protein of interest (POI) fused to Nano from the solution to the illuminated area on the membrane. This binding is reversible in the dark, which provides dynamic binding and release of the POI. Overall, this is a flexible and versatile method for regulating the localization of proteins with high precision in space and time using blue light.

Autor destacado: Reclutamiento de proteínas fotoconmutables para patrones reversibles en sistemas celulares artificiales

Here, a protocol is described for generating light-regulated and reversible protein patterns with high spatiotemporal precision at artificial lipid membranes. The method consists of the localized photoactivation of the protein iLID (improved light-inducible dimer) immobilized on model membranes that, under blue light, binds to its partner protein Nano (wild-type SspB).