Este protocolo permite a cualquier persona realizar experimentos FRET de una sola molécula para medir distancias absolutas precisas dentro de biomoléculas utilizando el smfBox, que es un instrumento barato, robusto y de código abierto. smFRET le permite observar una molécula a la vez, en lugar del promedio de muchos miles de millones de moléculas, para que pueda caracterizar las diferentes conformaciones que adoptan. La belleza de este método es que podría usarse para arrojar luz sobre la estructura y la dinámica de muchos sistemas biomoleculares.
Por ejemplo, el plegamiento de proteínas, las interacciones de ADN de proteínas y la alostería de ADN. Antes de comenzar un análisis, inicie el centro de control láser y confirme que el modo de corriente constante alterna de onda continua está seleccionado. Encendido en ambos láseres.
Inicie el software de adquisición smOTTER y confirme que cada instrumento está configurado correctamente. Para alinear la ruta de emisión, coloque una gota de aceite de inmersión sobre el objetivo y coloque cuidadosamente un vidrio de cubierta limpia sobre la lente del objetivo, bajando en ángulo con el aceite para evitar que queden burbujas de aire atrapadas entre el vidrio de la cubierta y el objetivo. Luego agregue 10 microlitros de tinte Cy3B nanomolar de 100 en el centro del vidrio de la cubierta.
En el panel de ciclos de trabajo del láser, ajuste el láser del donante a cero apagado, 45 encendido y 55 apagado. Ajuste el láser aceptor a 50 apagado, 45 encendido y cinco apagado. Ajuste la excitación láser alterna o el período ALEX a 100 microsegundos.
Abra la pestaña Enfoque Z. En el panel de adquisición, cambie los láseres a vivo e inicie la cámara. Ajuste la exposición para que aparezca un punto brillante rodeado centralmente por un fondo negro.
Comenzando desde una posición Z baja, aumente la altura hasta que el punto brillante alcance su tamaño mínimo. Luego eleve la altura hasta 20 micrómetros adicionales para enfocar el láser en la muestra por encima del aceite y cubrir el vidrio. Cuando la muestra entre en foco, detenga la cámara.
En el centro de control de omicrones, baje la potencia del láser verde mientras monitorea la escala del eje Y en la pestaña de alineación de smOTTER hasta que se observe la lectura de ambos detectores, cambiando la escala según sea necesario. Luego desenrosque los cuatro tornillos en la parte frontal del smfBox para quitar el panel frontal. Para alinear el agujero de alfiler, gire la perilla X en el posicionador estenopeico mientras observa la señal en la pestaña de alineación para aumentar la señal en verde y rojo.
Gire la perilla Y para alinear el agujero de alfiler en la otra dirección, luego regrese a la perilla X para verificar si hay un aumento adicional en la señal. Para alinear la lente estenopeica, gire la perilla X de la lente en una dirección para disminuir la señal, luego gire la perilla X estenopeica en la misma dirección para devolver la señal al nivel original. Si la nueva señal máxima es más alta que antes, continúe moviendo iterativamente las perillas estenopeicas y de la lente en esa dirección.
Si la señal es más baja que antes, mueva iterativamente las perillas en la dirección opuesta, luego repita la alineación usando las perillas estenopeicas y de lente Y. Para la alineación de la lente del fotodiodo de avalancha, comenzando con el fotodiodo de avalancha verde, mueva la perilla X hasta que la señal verde esté en su máximo. Repita la modificación de la señal para la perilla Y.
Regrese a la perilla X, moviéndose hacia adelante y hacia atrás para encontrar los puntos umbral en los que la señal comienza a caer. Deje la señal en una posición a medio camino entre estos dos puntos. Busque la posición de mitad de camino para la perilla Y y repita la alineación para el fotodiodo de avalancha roja.
Antes de analizar la primera muestra, limpie el escenario con tejido de limpieza de lente empapado en metanol, limpie suavemente el objetivo de un extremo a otro y aplique de tres a cuatro gotas de aceite de inmersión en el centro del objetivo. Agregue 10 microlitros de agua ultrapura tipo uno al centro de un vaso de cubierta limpia y monitoree el rastro de agua para confirmar que no se observen señales fluorescentes. Luego use pinzas de goma para quitar cuidadosamente el vidrio de la cubierta y reponer el aceite de inmersión si es necesario.
Para garantizar que se obtengan datos de una sola molécula, después de diluir la muestra, seleccione una concentración a la que se observen de una a cinco ráfagas por segundo en el panel de trazas en vivo. Cuando se haya determinado la concentración adecuada, presione aisladores de silicona de ocho a nueve milímetros de diámetro en el centro de un nuevo vidrio de cubierta y agregue cuidadosamente 10 microlitros de muestra en el centro, evitando el contacto con la silicona. Coloque firmemente el vidrio de la segunda cubierta sobre los aisladores hasta que se forme un sello.
Verifique el histograma de eficiencia de estequiometría en vivo versus FRET para observar si la muestra se está comportando como se esperaba. En el panel de configuración de guardado, ingrese la información para el nombre y los detalles de la muestra, las etiquetas de donante y aceptor, las longitudes de onda de excitación de búfer, donante y aceptor, las longitudes de onda de detección y la potencia del láser, la afiliación del usuario final y del usuario. En el panel de adquisición, introduzca la duración del experimento en minutos y seleccione un intervalo de guardado adecuado para mitigar cualquier posible pérdida de datos en caso de error.
Seleccione Guardar potencias láser si es necesario y, a continuación, haga clic en Iniciar para comenzar a adquirir los datos. En un resultado positivo, se obtendrán entre cinco y una ráfaga por segundo. En un resultado negativo, se observarán demasiadas o muy pocas ráfagas dentro del mismo período de tiempo.
Después de la recolección y el análisis, la gráfica de alternancia debe coincidir con el período ALEX de la configuración experimental. El rastro de tiempo se utiliza para evaluar cualitativamente que la concentración de la muestra es razonable. La gráfica de fondo muestra la distribución de los períodos de retardo entre fotones con un ajuste lineal a los tiempos más largos para estimar la tasa de fondo.
El rastro de fondo se puede utilizar para identificar si hubo cambios en la muestra durante la duración del experimento. Se generan histogramas de eficiencia de estequiometría versus FRET, seleccionando para todas las especies y especies doblemente etiquetadas. Se genera un histograma de eficiencia 1D FRET con el ajuste gaussiano de los datos.
Así que la concentración de la muestra aquí es clave. Si es demasiado alto, ya no está haciendo un experimento de una sola molécula, mientras que si es demasiado bajo, tomará demasiado tiempo obtener los datos. Ha permitido la determinación de estructuras de biomoléculas dinámicas, que no podrían determinarse mediante otros métodos como la RMN o la cristalografía.
