Ce protocole permet à quiconque de mener des expériences FRET à molécule unique pour mesurer des distances absolues précises dans les biomolécules à l’aide de la smfBox, qui est un instrument open source bon marché, robuste et bon marché. smFRET vous permet de regarder une molécule à la fois, plutôt que la moyenne de plusieurs milliards de molécules, de sorte que vous pouvez caractériser les différentes conformations qu’ils adoptent. La beauté de cette méthode est qu’elle pourrait être utilisée pour éclairer la structure et la dynamique de nombreux systèmes biomoléculaires.
Par exemple, le repliement des protéines, les interactions entre les protéines et l’allosterie de l’ADN. Avant de commencer une analyse, lancez le centre de contrôle laser et confirmez que le mode de courant constant alternatif à ondes continues est sélectionné. Allumez les deux lasers.
Lancez le logiciel d’acquisition smOTTER et confirmez que chaque instrument est correctement configuré. Pour aligner le chemin d’émission, placez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif et placez soigneusement un verre de couverture propre sur la lentille de l’objectif, en abaissant à un angle par rapport à l’huile pour éviter de piéger les bulles d’air entre le verre de couverture et l’objectif. Ajoutez ensuite 10 microlitres de colorant Cy3B nanomolaire de 100 nanomolaires sur le centre du verre de couverture.
Dans le panneau des cycles de service laser, réglez le laser donneur sur zéro désactivé, 45 activé et 55 désactivé. Réglez le laser accepteur sur 50 off, 45 on et five off. Réglez l’excitation laser alternée ou la période ALEX à 100 microsecondes.
Ouvrez l’onglet Z focus. Dans le panneau d’acquisition, mettez les lasers en direct et démarrez la caméra. Ajustez l’exposition de sorte qu’un point lumineux apparaisse au centre entouré d’un fond noir.
En partant d’une position Z basse, augmentez la hauteur jusqu’à ce que le point lumineux atteigne sa taille minimale. Ensuite, augmentez la hauteur jusqu’à 20 micromètres supplémentaires pour focaliser le laser dans l’échantillon au-dessus de l’huile et du verre de couverture. Lorsque l’échantillon est mis au point, arrêtez l’appareil photo.
Dans le centre de contrôle omicron, abaissez la puissance du laser vert tout en surveillant l’échelle de l’axe Y dans l’onglet d’alignement de smOTTER jusqu’à ce que la lecture des deux détecteurs soit observée, en modifiant l’échelle si nécessaire. Ensuite, dévissez les quatre vis à l’avant de la smfBox pour retirer le panneau avant. Pour aligner le sténopé, tournez le bouton X sur le positionneur du sténopé tout en regardant le signal sur la languette d’alignement pour augmenter le signal en vert et en rouge.
Tournez le bouton Y pour aligner le sténopé dans l’autre sens, puis revenez au bouton X pour vérifier toute nouvelle augmentation du signal. Pour aligner l’objectif sténopé, tournez le bouton X de l’objectif dans une direction pour diminuer le signal, puis tournez le bouton X du sténopé dans la même direction pour ramener le signal au niveau d’origine. Si le nouveau signal max est plus élevé qu’auparavant, continuez à déplacer de manière itérative le sténopé et les boutons de l’objectif dans cette direction.
Si le signal est plus faible qu’auparavant, déplacez les boutons de manière itérative dans la direction opposée, puis répétez l’alignement à l’aide du sténopé et des boutons Y de l’objectif. Pour l’alignement de la lentille de la photodiode d’avalanche, en commençant par la photodiode d’avalanche verte, déplacez le bouton X jusqu’à ce que le signal vert soit à son maximum. Répétez la modification du signal pour le bouton Y.
Revenez au bouton X, en vous déplaçant d’avant en arrière pour trouver les points de seuil auxquels le signal commence à tomber. Laissez le signal à une position à mi-chemin entre ces deux points. Trouvez la position à mi-chemin du bouton Y et répétez l’alignement de la photodiode d’avalanche rouge.
Avant d’analyser le premier échantillon, nettoyez la scène avec du papier hygiénique imbibé de méthanol, essuyez doucement l’objectif d’un bout à l’autre et appliquez trois à quatre gouttes d’huile d’immersion sur le centre de l’objectif. Ajoutez 10 microlitres d’eau ultrapure de type un au centre d’un verre de couverture propre et surveillez la trace d’eau pour confirmer qu’aucun signal fluorescent n’est observé. Ensuite, utilisez une pince à épiler en caoutchouc pour retirer soigneusement le verre de couverture et reconstituer l’huile d’immersion si nécessaire.
Pour s’assurer qu’une seule molécule est obtenue, après dilution de l’échantillon, sélectionnez une concentration à laquelle une à cinq rafales par seconde sont observées dans le panneau de trace vivante. Lorsque la concentration appropriée a été déterminée, pressez des isolateurs en silicone de huit à neuf millimètres de diamètre sur le centre d’un nouveau verre de couverture et ajoutez soigneusement 10 microlitres d’échantillon au centre, en évitant tout contact avec le silicone. Placez fermement le deuxième verre de couverture sur les isolateurs jusqu’à ce qu’un joint soit formé.
Vérifiez l’histogramme d’efficacité de la stœchiométrie en direct par rapport à l’efficacité FRET pour observer si l’échantillon se comporte comme prévu. Dans le panneau des paramètres d’enregistrement, entrez les informations relatives au nom et aux détails de l’échantillon, aux étiquettes du donneur et de l’accepteur, aux longueurs d’onde d’excitation du tampon, du donneur et de l’accepteur, aux longueurs d’onde de détection et à la puissance laser, à l’utilisateur final et à l’affiliation de l’utilisateur. Dans le panneau d’acquisition, entrez la durée de l’expérience en minutes et sélectionnez un intervalle de sauvegarde approprié pour atténuer toute perte de données potentielle en cas d’erreur.
Sélectionnez Enregistrer les puissances laser si nécessaire, puis cliquez sur Démarrer pour commencer à acquérir les données. Dans un résultat positif, entre cinq et une rafale seront obtenues par seconde. Dans un résultat négatif, trop ou trop peu de rafales seront observées dans le même délai.
Après la collecte et l’analyse, le diagramme d’alternance doit correspondre à la période ALEX de la configuration expérimentale. La trace temporelle est utilisée pour évaluer qualitativement que la concentration de l’échantillon est raisonnable. Le diagramme de fond montre la distribution des périodes de retard interphotoniques avec un ajustement linéaire aux temps plus longs pour estimer le taux de fond.
La trace de fond peut être utilisée pour identifier s’il y a eu des changements dans l’échantillon au cours de la durée de l’expérience. Des histogrammes d’efficacité stœchiométrie versus FRET sont générés, en sélectionnant pour toutes les espèces et les espèces doublement marquées. Un histogramme d’efficacité FRET 1D est généré avec l’ajustement gaussien des données.
La concentration de l’échantillon ici est donc essentielle. S’il est trop élevé, vous ne faites plus d’expérience à molécule unique, alors que s’il est trop bas, il faudra trop de temps pour obtenir les données. Il a permis de déterminer les structures de biomolécules dynamiques, qui n’ont pas pu être déterminées par d’autres méthodes comme la RMN ou la cristallographie.
