Dieses Protokoll ermöglicht es jedem, Einzelmolekül-FRET-Experimente durchzuführen, um genaue absolute Entfernungen innerhalb von Biomolekülen mit der smfBox zu messen, einem billigen, robusten Open-Source-Instrument. smFRET ermöglicht es Ihnen, ein Molekül nach dem anderen zu betrachten, anstatt die durchschnittlich vielen Milliarden von Molekülen, so dass Sie die verschiedenen Konformationen, die sie annehmen, charakterisieren können. Das Schöne an dieser Methode ist, dass sie verwendet werden könnte, um die Struktur und Dynamik vieler biomolekularer Systeme zu beleuchten.
Zum Beispiel Proteinfaltung, Protein-DNA-Interaktionen und DNA-Allosterie. Bevor Sie mit einer Analyse beginnen, starten Sie das Laserkontrollzentrum und vergewissern Sie sich, dass der Konstantstrom-Wechselstrommodus mit kontinuierlicher Welle ausgewählt ist. Schalten Sie beide Laser ein.
Starten Sie die smOTTER Erfassungssoftware und bestätigen Sie, dass jedes Gerät korrekt konfiguriert ist. Um den Emissionspfad auszurichten, geben Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Objektiv und legen Sie vorsichtig ein sauberes Deckglas auf die Objektivlinse, wobei Sie sich in einem Winkel zum Öl absenken, um luftblasen zwischen dem Deckglas und dem Objektiv einzufangen. Dann fügen Sie 10 Mikroliter 100 nanomolar Cy3B Farbstoff auf die Mitte des Deckglases.
Stellen Sie im Laser-Arbeitszyklus-Panel den Spenderlaser auf Null aus, 45 ein und 55 aus. Stellen Sie den Akzeptorlaser auf 50 aus, 45 ein und fünf aus. Stellen Sie die abwechselnde Laseranregung oder ALEX-Periode auf 100 Mikrosekunden ein.
Öffnen Sie die Registerkarte Z-Fokus. Schalten Sie im Erfassungsbereich die Laser auf Live und starten Sie die Kamera. Passen Sie die Belichtung so an, dass ein heller Fleck zentral von einem schwarzen Hintergrund umgeben erscheint.
Ausgehend von einer niedrigen Z-Position erhöhen Sie die Höhe, bis der helle Fleck seine minimale Größe erreicht. Erhöhen Sie dann die Höhe auf weitere 20 Mikrometer, um den Laser in der Probe über dem Öl- und Deckglas zu fokussieren. Wenn die Probe in den Fokus kommt, stoppen Sie die Kamera.
Senken Sie im Omicron-Kontrollzentrum die grüne Laserleistung, während Sie die y-Achsenskala in der Ausrichtungsregisterkarte von smOTTER überwachen, bis die Anzeige von beiden Detektoren beobachtet wird, und ändern Sie die Skala nach Bedarf. Schrauben Sie dann die vier Schrauben an der Vorderseite der smfBox ab, um die Frontplatte zu entfernen. Um das Loch auszurichten, drehen Sie den X-Knopf am Lochlochpositionierer, während Sie das Signal auf der Ausrichtungslasche beobachten, um das Signal in Grün und Rot zu erhöhen.
Drehen Sie den Y-Knopf, um das Loch in die andere Richtung auszurichten, und kehren Sie dann zum X-Knopf zurück, um nach einer weiteren Erhöhung des Signals zu suchen. Um die Lochlinse auszurichten, drehen Sie den Objektiv-X-Knopf in eine Richtung, um das Signal zu verringern, und drehen Sie dann den Loch-X-Knopf in die gleiche Richtung, um das Signal auf den ursprünglichen Pegel zurückzusetzen. Wenn das neue max-Signal höher ist als zuvor, bewegen Sie sowohl das Loch als auch die Objektivknöpfe iterativ in diese Richtung.
Wenn das Signal niedriger ist als zuvor, bewegen Sie die Knöpfe iterativ in die entgegengesetzte Richtung und wiederholen Sie dann die Ausrichtung mit den Pinhole- und Objektiv-Y-Knöpfen. Zur Ausrichtung der Lawinenphotodiodenlinse, beginnend mit der grünen Lawinenphotodiode, bewegen Sie den X-Knopf, bis das grüne Signal maximal ist. Wiederholen Sie die Signaländerung für den Y-Knopf.
Kehren Sie zum X-Knopf zurück und bewegen Sie sich hin und her, um die Schwellenwerte zu finden, an denen das Signal zu fallen beginnt. Lassen Sie das Signal an einer Position auf halbem Weg zwischen diesen beiden Punkten. Finden Sie die halbe Position für den Y-Knopf und wiederholen Sie die Ausrichtung für die rote Lawinen-Fotodiode.
Bevor Sie die erste Probe analysieren, reinigen Sie die Stufe mit methanolgetränktem Linsenreinigungsgewebe, wischen Sie vorsichtig über das Objektiv von einem Ende zum anderen und tragen Sie drei bis vier Tropfen Tauchöl auf die Mitte des Objektivs auf. Fügen Sie 10 Mikroliter Reinstwasser vom Typ eins in die Mitte eines sauberen Deckglases und überwachen Sie die Wasserspur, um zu bestätigen, dass keine Fluoreszenzsignale beobachtet werden. Entfernen Sie dann mit einer Pinzette mit Gummiende das Deckglas vorsichtig und füllen Sie das Tauchöl bei Bedarf wieder auf.
Um sicherzustellen, dass Einzelmoleküldaten erhalten werden, wählen Sie nach dem Verdünnen der Probe eine Konzentration, bei der ein bis fünf Ausbrüche pro Sekunde im Live-Trace-Panel beobachtet werden. Wenn die geeignete Konzentration bestimmt wurde, drücken Sie Silikonisolatoren mit einem Durchmesser von acht bis neun Millimetern auf die Mitte eines neuen Deckglases und geben Sie vorsichtig 10 Mikroliter Probe in die Mitte, um den Kontakt mit dem Silikon zu vermeiden. Legen Sie das zweite Deckglas fest auf die Isolatoren, bis eine Dichtung gebildet ist.
Überprüfen Sie das Live-Stöchiometrie- und FRET-Effizienzhistogramm, um zu beobachten, ob sich die Probe wie erwartet verhält. Geben Sie im Bereich "Speichereinstellungen" die Informationen für den Probennamen und die Details, Spender- und Akzeptoretiketten, Puffer-, Spender- und Akzeptoranregungswellenlängen, Detektionswellenlängen und Laserleistung, Endbenutzer- und Benutzerzugehörigkeit ein. Geben Sie im Erfassungsbereich die Testlänge in Minuten ein und wählen Sie ein geeignetes Speicherintervall aus, um einen möglichen Datenverlust im Fehlerfall zu verringern.
Wählen Sie bei Bedarf Laserleistung speichern aus, und klicken Sie dann auf Start, um mit der Datenerfassung zu beginnen. Bei einem positiven Ergebnis werden zwischen fünf und einem Burst pro Sekunde erhalten. Bei einem negativen Ergebnis werden zu viele oder zu wenige Ausbrüche innerhalb desselben Zeitrahmens beobachtet.
Nach der Sammlung und Analyse sollte das Wechseldiagramm mit der ALEX-Periode des Versuchsaufbaus übereinstimmen. Die Zeitspur wird verwendet, um qualitativ zu beurteilen, ob die Probenkonzentration angemessen ist. Das Hintergrunddiagramm zeigt die Verteilung der Interphotonenverzögerungsperioden mit einer linearen Anpassung an die längeren Zeiten, um die Hintergrundrate abzuschätzen.
Die Hintergrundspur kann verwendet werden, um festzustellen, ob es während der Dauer des Experiments Änderungen in der Probe gab. Stöchiometrie versus FRET-Effizienzhistogramme werden generiert, die für alle Arten und doppelt markierten Arten ausgewählt werden. Ein 1D-FRET-Effizienzhistogramm wird mit Gaußscher Anpassung der Daten generiert.
Die Konzentration der Probe hier ist also der Schlüssel. Wenn es zu hoch ist, führen Sie kein Einzelmolekül-Experiment mehr durch, während es zu niedrig ist, zu lange dauert, um die Daten zu erhalten. Es ermöglicht die Bestimmung von Strukturen dynamischer Biomoleküle, die mit anderen Methoden wie NMR oder Kristallographie nicht bestimmt werden konnten.
