Bu protokol, ucuz, sağlam, açık kaynaklı bir cihaz olan smfBox'ı kullanarak biyomoleküller içindeki doğru mutlak mesafeleri ölçmek için herkesin tek moleküllü FRET deneyleri yapmasını sağlar. smFRET, ortalama milyarlarca molekül yerine aynı anda bir moleküle bakmanıza izin verir, böylece benimsedikleri farklı konformasyonları karakterize edebilirsiniz. Bu yöntemin güzelliği, birçok biyomoleküler sistemin yapısına ve dinamiklerine ışık tutmak için kullanılabilmesidir.
Örneğin, protein katlama, protein DNA etkileşimleri ve DNA allosteri. Bir analize başlamadan önce, lazer kontrol merkezini başlatın ve sürekli dalga alternatif sabit akım modunun seçildiğini onaylayın. İki lazeri de çalıştır.
smOTTER alma yazılımını başlatın ve her bir cihazın doğru şekilde yapılandırıldığını onaylayın. Emisyon yolunu hizalamak için, hedefe bir damla daldırma yağı yerleştirin ve kapak camı ile amaç arasında hava kabarcıklarının sıkışmasını önlemek için yağa bir açıyla indirerek objektif lense dikkatlice temiz bir kapak camı yerleştirin. Daha sonra kapak camının ortasına 100 nanomoler Cy3B boyadan oluşan 10 mikrolitre ekleyin.
Lazer görev döngüleri panelinde donör lazeri sıfır kapalı, 45 açık ve 55 kapalı olarak ayarlayın. Kabul eden lazeri 50 kapalı, 45 açık ve beş kapalı olarak ayarlayın. Alternatif lazer uyarlama veya ALEX periyodunu 100 mikrosaniyeye ayarlayın.
Z odağı sekmesini açın. Alım panelinde, lazerleri canlı olarak değiştirin ve kamerayı başlatın. Pozlamayı, parlak bir noktanın merkezi olarak siyah bir arka planla çevrili görünecek şekilde ayarlayın.
Düşük Z konumundan başlayarak, parlak nokta minimum boyutuna ulaşana kadar yüksekliği artırın. Daha sonra lazeri numuneye yağ ve kapak camının üzerine odaklamak için yüksekliği ek 20 mikrometreye kadar yükseltin. Örnek netleme geldiğinde kamerayı durdurun.
Omicron kontrol merkezinde, her iki dedektörden de okuma gözlenene kadar smOTTER'ın hizalama sekmesindeki y ekseni ölçeğini izlerken yeşil lazer gücünü düşürün ve ölçeği gerektiği gibi değiştirin. Ardından ön paneli çıkarmak için smfBox'ın önündeki dört vidayı sökün. İğne deliğini hizalamak için, sinyali yeşil ve kırmızı olarak artırmak için hizalama sekmesindeki sinyali izlerken iğne deliği konumlandırıcısındaki X düğmesini çevirin.
İğne deliğini diğer yöne hizalamak için Y düğmesini çevirin, ardından sinyalde daha fazla artış olup olmadığını kontrol etmek için X düğmesine dönün. Pim deliği lensini hizalamak için, sinyali azaltmak için X düğmesini bir yönde çevirin, ardından sinyali orijinal seviyeye döndürmek için iğne deliği X düğmesini aynı yönde çevirin. Yeni maksimum sinyal öncekinden daha yüksekse, hem iğne deliğini hem de lens düğmelerini bu yönde yinelemeli olarak hareket ettirmeye devam edin.
Sinyal öncekinden daha düşükse, düğmeleri tekrar tekrar ters yönde hareket ettirin, ardından iğne deliği ve lens Y düğmelerini kullanarak hizalamayı tekrarlayın. Çığ fotodiyot lensinin hizalanması için, yeşil çığ fotodiyot ile başlayarak, yeşil sinyal maksimum olana kadar X düğmesini hareket ettinin. Y düğmesi için sinyal değişikliğini tekrarlayın.
Sinyalin düşmeye başladığı eşik noktalarını bulmak için ileri geri hareket derek X düğmesine dönün. Sinyali bu iki noktanın ortasında bir konumda bırakın. Y düğmesi için yarı konumu bulun ve kırmızı çığ fotodiyot için hizalamayı tekrarlayın.
İlk numuneyi analiz etmeden önce, sahneyi metanolle ıslatılmış lens temizleme dokusuyla temizleyin, hedefi bir uçtan diğerine hafifçe silin ve hedefin merkezine üç ila dört damla daldırma yağı uygulayın. Temiz bir kapak camının ortasına 10 mikrolitre tip bir ultra saf su ekleyin ve floresan sinyallerin görülmediğini doğrulamak için su izini izleyin. Daha sonra kapak camını dikkatlice çıkarmak ve gerekirse daldırma yağını doldurmak için kauçuk uçlu cımbız kullanın.
Tek moleküllü bir veri elde edildikten emin olmak için, numuneyi seyrelttikten sonra, canlı izleme panelinde saniyede bir ila beş patlamanın gözlendiği bir konsantrasyon seçin. Uygun konsantrasyon belirlendiğinde, sekiz ila dokuz milimetre çapında silikon izolatörleri yeni bir kapak camının ortasına bastırın ve silikonla temastan kaçınarak merkeze dikkatlice 10 mikrolitre numune ekleyin. bir conta oluşana kadar ikinci kapak camını izolatörlerin üzerine sıkıca yerleştirin.
Numunenin beklendiği gibi davranıp davranmadığını gözlemlemek için canlı stoichiometry ile FRET verimlilik histogramını kontrol edin. Ayarları kaydet panelinde, örnek adı ve ayrıntıları, donör ve alıcı etiketleri, tampon, donör ve alıcı heyecan dalga boyları, algılama dalga boyları ve lazer gücü, son kullanıcı ve kullanıcı bağlantısı bilgilerini girin. Edinme panelinde, deneme uzunluğunu dakika cinsinden girin ve bir hata durumunda olası veri kaybını azaltmak için uygun bir kaydetme aralığı seçin.
Gerekirse lazer güçlerini kaydet'i seçin, ardından verileri almaya başlamak için Başlat'ı tıklatın. Olumlu bir sonuçla, saniyede beş ila bir patlama elde edilecektir. Olumsuz bir sonuçta, aynı zaman dilimi içinde çok fazla veya çok az patlama gözlenecektir.
Toplama ve analizden sonra, değişim grafiği deneysel kurulumun ALEX dönemiyle eşleşmelidir. Zaman izi, numune konsantrasyonu makul olduğunu nitel olarak değerlendirmek için kullanılır. Arka plan çizimi, arka plan oranını tahmin etmek için fotonlar arası gecikme sürelerinin dağılımını daha uzun sürelere doğrusal bir uyumla gösterir.
Arka plan izlemesi, deneme süresi boyunca örnekte değişiklik olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Stoichiometry ve FRET verimlilik histogramları üretilir, tüm türler ve iki kat etiketli türler için seçilir. Verilerin Gauss montajı ile 1D FRET verimlilik histogramı oluşturulur.
Yani buradaki numunenin konsantrasyonu çok önemli. Eğer çok yüksekse, artık tek moleküllü bir deney yapmıyorsunuz, oysa çok düşükse, verileri almak çok uzun sürecektir. NMR veya kristalografi gibi diğer yöntemlerle belirlenemeyen dinamik biyomoleküllerin yapılarının belirlenmesini sağladı.
