Este protocolo se puede utilizar para la detección y caracterización de la dinámica conformacional de proteínas, que son esenciales para la comprensión de una gran variedad de procesos celulares. En comparación con otros métodos, este método no requiere pasos especializados en la preparación de muestras y proporciona una caracterización exhaustiva de la cinética, la termodinámica y los aspectos estructurales del equilibrio de confirmación. La dispersión de relajación cpmg se puede aplicar más ampliamente para la caracterización de la dinámica de confirmación en ácidos nucleicos y otras biomoléculas, así como para la caracterización de las interacciones de nanopartículas de ligandos.
Nuestro protocolo está dirigido a usuarios de CPMG por primera vez. Por lo tanto, es un buen punto de partida. Sin embargo, esperamos que los usuarios sepan los pasos básicos para ejecutar experimentos convencionales del RMN.
Para configurar un experimento de RMN por primera vez, primero descargue y descomprima estos archivos suplementarios. Copie los bits. vv y trosy_15N_CPMG.
vv en la carpeta del programa pulse al directorio del programa pulse. Abra el software de adquisición y utilice el comando EDC para copiar un experimento HSQC de nitrógeno de hidrógeno 15 ejecutado anteriormente en un nuevo experimento. Utilice el comando pulse program para cargar el trosy_15N_CPMG.
vv pulse en el experimento recién creado. A continuación, utilice las instrucciones del final del archivo de programa de pulsos para configurar el experimento CPMG. Para configurar un experimento rutinario de RMN, introduzca la muestra en el imán y realice todos los pasos básicos de adquisición de RMN.
Fije P1 a la duración de los pulsos duros del hidrógeno de 90 grados y P7 a la duración del nitrógeno 15 pulsos duros de 90 grados. En la ventana de adquisición, establezca el centro y el ancho espectral para las dimensiones de hidrógeno y nitrógeno 15. Establezca el retardo de relajación en 0,7 T2 y utilice el comando VC list para crear una lista de números enteros correspondientes a N.Después de confirmar que cada entrada de la lista corresponde a un campo CPMG diferente según CPMG archivado es igual a veces 4N dividido por D30, compruebe que el primer número de la lista es cero.
Fije L8 al número de entradas en la lista del VC, L3 al número de puntos verdaderos para la dimensión indirecta, y 1TD a L8 por L3 por dos. Para optimizar la supresión de agua, establezca la ganancia del receptor en uno y escriba EDC pull para abrir el archivo de programa de impulsos. En la línea 91, quite el punto y coma anterior a goto 999 y guarde el archivo.
Mediante el comando GS, ajuste los parámetros SPDB0 para minimizar la intensidad de la señal FID. Cuando se haya modificado la intensidad de la señal, vuelva a introducir un punto y coma en la línea 91 del archivo de programa de impulsos y guarde el archivo. Para optimizar SPDB11, establezca la ganancia del receptor en uno y el tipo EDC pull para abrir el archivo de programa de impulsos.
En la línea 168, quite el punto y coma anterior a goto 999 y guarde el archivo. Con el comando GS, ajuste los parámetros spdb11 para minimizar la intensidad de la señal FID. Cuando se haya modificado la intensidad de la señal, vuelva a introducir el punto y coma en la línea 168 y guarde el archivo.
Para optimizar SPDB2, establezca la ganancia del receptor en uno e introduzca EDC pull para abrir el archivo de programa de impulsos. En la línea 179, quite el punto y coma anterior a goto 999 y guarde el archivo. Mediante el comando GS, ajuste los parámetros spdb2 para minimizar la intensidad de la señal FID.
Cuando se haya modificado la intensidad de la señal, vuelva a introducir el punto y coma en la línea 179 del archivo de programa de impulsos y guarde el archivo. Para optimizar PLDB2, establezca la ganancia del receptor en uno e introduzca EDC pull para abrir el archivo de programa de impulsos. En la línea 184, quite el punto y coma anterior a goto 999 y guarde el archivo.
Usando el comando GS, ajuste los parámetros PLDB2 para minimizar la intensidad de la señal FID. Cuando se haya modificado la intensidad de la señal, vuelva a introducir el punto y coma en la línea 184 del archivo de programa de impulsos y guarde el archivo. Ejecute el comando RGA para optimizar la ganancia del receptor.
A continuación, ejecute el comando ZG para iniciar el experimento. En esta figura se pueden observar los resultados de los perfiles de dispersión de relajación adquiridos para cada pico en el espectro de hidrógeno nitrógeno 15 Trosy. A partir de los perfiles de dispersión de relajación adquiridos, es posible estimar la contribución de intercambio a la relajación transversal de nitrógeno 15 de cada grupo AMI de la columna vertebral.
Al trazar la relajación transversal en la estructura 3D de la proteína bajo investigación, es posible identificar las regiones estructurales sometidas a intercambio confirmacional en la escala de tiempo de milisegundos de microsegundos. El modelado de las curvas de dispersión de relajación utilizando las ecuaciones de Carver-Richards devuelve los parámetros termodinámicos y cinéticos en el proceso de intercambio, como las poblaciones fraccionarias de los estados en equilibrio y la tasa de cambio entre estos estados. La dependencia de la temperatura de estos parámetros termodinámicos y cinéticos se puede modelar utilizando las ecuaciones de van't Hoff y I-ring, respectivamente, para obtener información detallada sobre la energética del intercambio de confirmación.
Es crucial optimizar cuidadosamente todos los parámetros de adquisición, en particular P7. También es importante producir muestras altamente puras y homogéneas para evitar dispersiones espurias. Los parámetros cinéticos, termodinámicos y químicos obtenidos mediante este protocolo se pueden utilizar para obtener información energética y estructural sobre las especies sometidas al intercambio de confirmación. La caracterización de la dinámica de confirmación de proteínas obtenida por los métodos de CPMG proporciona información crucial para la comprensión de la señalización y la actividad enzimática, así como nuevas perspectivas para el diseño de fármacos.
