La técnica de mejora de la relajación paramagnética se puede utilizar para caracterizar y medir distancias intermoleculares y cuantificar interacciones biomoleculares transitorias y/o poco pobladas. Aquí, hemos aplicado esta técnica para capturar las interacciones que preceden a la condensación de proteínas. La sensibilidad de los PRE permite la identificación, detección y cuantificación de la resolución atómica de estados dinámicos que permanecen invisibles e inaccesibles para otras técnicas de RMN.
Los pasos clave de este protocolo incluyen la eliminación de la etiqueta de espín de nitrógeno no conjugado y el análisis cuidadoso de los espectros para medir con precisión la altura del pico. Además, se debe tener precaución durante la configuración del experimento de RMN y la calibración del pulso. Para comenzar, agregue 3-maleimido-PROXYL de una solución madre a 20 veces el exceso molar de la proteína de interés marcada isotópicamente con 15N.
Incubar durante la noche a temperatura ambiente o cuatro grados centígrados, protegido de la luz y el oxígeno y con un suave balanceo o nutación. Al día siguiente, retire la etiqueta de giro libre sin reacción para evitar la aparición de disolventes no específicos mediante diálisis extensa de la muestra de proteínas o mediante filtración en gel. A continuación, utilice el reactivo de Ellman para cuantificar los grupos sulfhidrilo libres en la solución.
Mida la absorbancia con un lector de microplacas y construya la curva estándar. Para medir el PRE intramolecular, prepare una proteína marcada con espín enriquecida isotópicamente con 15N a una concentración de al menos 100 micromolares, pero no más de 300 micromolares, en un tampón adecuado para RMN. Luego, con una pipeta de vidrio de tallo largo o una micropipeta, transfiera la muestra de RMN a un tubo de RMN de cinco milímetros apropiado para su uso en imanes de alto campo.
Coloque la muestra en el imán. Bloquee la señal de deuterio usando el comando de bloqueo y sintonice y haga coincidir el canal de protones de acuerdo con los protocolos de la instalación. A continuación, ajuste las cuñas utilizando la subrutina de cuñas superior para optimizar la supresión de la señal del disolvente.
A continuación, calibra el pulso de protones utilizando el programa P-OPT. A continuación, calibre el pulso de 15N con una muestra estándar. Determine la atenuación correcta para pulsos con forma utilizando la subrutina de la herramienta de forma.
A continuación, abra el archivo de forma de pulso correspondiente haciendo clic en el icono de carpeta. Los pulsos con forma se encuentran en la sección de parámetros de pulso de los parámetros de adquisición. Después de cargar el archivo de definición de pulso, haga clic en Analizar forma de onda, seguido de Integrar forma.
Ingrese el pulso duro de 90 grados del protón calibrado, la forma deseada, la longitud del pulso y la rotación. A continuación, calcule el nivel de potencia del pulso con forma sumando el cambio de nivel de potencia a la atenuación del pulso calibrado de 90 grados. Registre un HSQC de protón 15N estándar para optimizar el ancho de barrido, la frecuencia portadora y verificar la supresión de agua.
Por último, ajuste la anchura de barrido y el número de incrementos de cota indirectos mediante los comandos SW y TD o directamente en los cuadros de diálogo correspondientes. Calibra los pulsos con forma como se ha demostrado anteriormente. A continuación, introduzca las longitudes de pulso calibradas en la sección de parámetros de pulso de la pestaña Parámetros de adquisición.
Para medir el protón amida T2 utilizando el enfoque de dos puntos de retardo de tiempo, establezca los retardos de tiempo editando el archivo de lista VD. El primer retardo se establece en 0,01 milisegundos. Utilizando la relación con el PRE máximo esperado, elija el segundo retraso.
A continuación, determine un valor adecuado comparando los primeros incrementos del primer y segundo espectros de retardo y ajustando el segundo retardo de modo que la señal decaiga entre el 40 y el 50% de su valor inicial. Determine el número de puntos complejos que se van a registrar y el número de escaneos para obtener un promedio de señal suficiente. A continuación, utilice el comando EXPT para calcular el tiempo del experimento e inicie el experimento con el comando ZG. Después de disolver el ascorbato de sodio en el tampón de RMN, ajuste el pH para que coincida con el del tampón de RMN original.
A continuación, agregue el ácido ascórbico al tubo de RMN con un exceso de 10 veces molar sobre la concentración de la etiqueta de centrifugado colocando una gota debajo del borde del tubo. Tape el tubo e inviértalo con cuidado para mezclar. Girar a 200 a 400 G durante 10 a 20 segundos en una centrífuga manual para asentar la muestra en el fondo del tubo.
Después de envolver el tubo en papel de aluminio, deje que la reacción continúe durante al menos tres horas. A continuación, registre el protón amida T2 en la muestra diamagnética utilizando los mismos parámetros utilizados para la muestra paramagnética. Se registraron PREs de protones de amida intramoleculares en un fragmento intrínsecamente desordenado autoasociado derivado del dominio de baja complejidad de la proteína de unión al ARN EWSR1.
Se espera que los residuos en estrecha proximidad secuencial al punto de fijación de la etiqueta giratoria se amplíen significativamente y no sean detectables en el espectro. Los residuos que estaban espaciados secuencialmente desde el punto de unión, pero que mostraban una gamma mejorada, estaban espacialmente cerca de la etiqueta de espín. En el caso de proteínas intrínsecamente desordenadas, el registro y análisis de los purés proporcionará información sobre los contactos intramoleculares y las superficies de interacción transitorias.
La combinación de las mediciones de PRE con otros métodos biofísicos, como la dispersión dinámica de la luz, la cromatografía de exclusión por tamaño, la ultracentrifugación analítica y los métodos computacionales, puede proporcionar una visión más profunda. La medición de PRE ayuda a caracterizar el estado transitorio escasamente poblado. Este enfoque podría ampliarse para caracterizar interacciones importantes para una miríada de procesos biológicos, como el reconocimiento molecular, la selección conformacional alostérica y los procesos de ensamblaje, incluido el ensamblaje de orgánulos sin membrana a través de la separación de fases.
