El siguiente protocolo presenta cómo configurar un experimento de eco de espín de neutrones para medir la función de dispersión intermedia e investigar la dinámica de las proteínas en solución. La principal ventaja de la espectroscopia de eco de espín de neutrones es su capacidad para observar el reordenamiento de los dominios y subdominios de proteínas en la escala de tiempo de pico a nanosegundo; que es el rango de cámaras lentas en proteínas en su entorno casi natural y en la solución de proteínas abarrotada. Neutron Spin Echo también es sensible a la configuración isotópica, lo que permite estudios muy específicos y específicos utilizando la coincidencia de contraste.
La comprensión de la dinámica del dominio de las proteínas es una parte importante de la investigación biofísica en la difícil tarea en curso de transmitir los movimientos del dominio de las proteínas con su funcionalidad biológica. El protocolo presentado aquí se puede aplicar generalmente a cualquier medición de neutron spin echo realizada en el espectrómetro SNS-NSE, independientemente de su elección de muestras, si una se mantiene dentro del ámbito de los materiales de materia blanda. Para configurar el experimento, comience seleccionando el grosor de la carga de la muestra celular, en función de la concentración de la muestra de proteína, la temperatura necesaria para la medición y la cantidad de solución disponible.
Limpie la célula con detergente para platos sin fosfato, agua desionizada y 70% de dietanol. Seque la celda en el horno de convección. Cargue cuatro mililitros de solución de proteína en la célula y cierre con tapas.
Use una película de cera o cualquier sellador para sellar las células de la muestra. Cargue cuatro mililitros de tampón de diálisis en un recipiente idéntico al de la muestra de proteína y el sello. Transportar muestras a la línea de haz.
Cierre el obturador e ingrese al área de la cueva del recinto del espectrómetro. Monte la celda de muestra en el portamuestras de aluminio apretando los tornillos y las placas de sujeción. Monte la muestra de grafito y la muestra de polvo de óxido de aluminio cargada en un recipiente idéntico al de la muestra de proteína.
Coloque el mismo soporte deslizándolo suavemente en la lata del sistema de forzamiento de temperatura. Cierre la tapa del sistema de forzamiento de temperatura y ajuste la temperatura al valor deseado accediendo a la pantalla interactiva del sistema de forzamiento de temperatura. Monte la cámara de neutrones para la alineación de las muestras con el haz.
Para recopilar los datos de la espectroscopia de eco de espín de neutrones, alinee la muestra en el haz de neutrones utilizando la cámara de neutrones y las cuatro aberturas de muestra independientes. Abra el software de recopilación de datos Spallation Neutron Source, Neutron Spin Echo Spectroscopy y recopile estadísticas de muestra ejecutando escaneos de defracción para los ángulos de dispersión y la longitud de onda deseados. Configure los parámetros de medición en función de las estadísticas recopiladas para cada muestra editando las macros de medición proporcionadas por el Científico de Instrumentos Asistente.
Comience a escanear escribiendo el nombre del protocolo en el símbolo del sistema y adquiriendo ecos para la muestra. Inicie sesión en el clúster de análisis remoto de Neutron Sciences con las credenciales de usuario de ORNL y pulse el botón de sesión de inicio. En el directorio de usuario, abra una ventana de terminal y escriba el comando de configuración del software.
A continuación, escriba el comando de entorno. Cree una carpeta para la reducción de datos en el directorio principal y copie los scripts y macros proporcionados desde el directorio compartido. Edite, cambie el nombre y guarde la macro de reducción proporcionada en consecuencia.
Escriba drspine" en el símbolo del sistema y presione Entrar para iniciar el entorno de reducción de software. Escriba el nombre de la macro de reducción en el símbolo del sistema dentro del entorno de software y presione Entrar. Edite el script de Python proporcionado por el científico de instrumentos asistente con los nombres de los datos de archivo reducidos.
Edite la función para que se ajuste desde la biblioteca proporcionada. Escriba el nombre del script editado en el símbolo del sistema y presione Entrar para leer, ajustar y trazar datos NSE reducidos. La función de dispersión intermedia medida por NSE para las proteínas IgG y MBP muestra una clara desviación de un proceso de relajación simple similar a la difusión en la escala de tiempo corta de cuatro años, lo que indica la accesibilidad de la dinámica interna de la proteína por NSE, y la necesidad de un modelo más complejo para describir los procesos dinámicos observados.
Los resultados de los cálculos de la función de dispersión intermedia ajustados por el modelado atómico de ambas proteínas utilizando modelos desarrollados por fueron excelentes con los datos experimentales de NSE. Los resultados demostraron que la dinámica más lenta observada en tiempos más largos puede atribuirse a los procesos generales de difusión traslacional y rotacional, mientras que la dinámica observada en las escalas de tiempo cortas se puede atribuir a la dinámica de los dominios de proteínas. Una cosa importante a recordar es la necesidad de muestras bien preparadas y limpias para las mediciones de NSE.
Una buena muestra para un Spin Echo tiene una relación de volteo superior a tres, que es la relación entre la dispersión coherente e incoherente de la muestra. También durante la preparación de la muestra y la carga de la muestra en las células NSE, la solución de muestra debe mantenerse segura y libre de cualquier contaminación cruzada química o biológica. Por razones de seguridad, la entrada en el recinto del espectrómetro solo debe intentarse después de que se cierre la persiana, y se ha permitido un tiempo adicional de media hora para el enfriamiento por radiación del recinto.
Se recomienda la dispersión de neutrones de ángulo pequeño para evaluar la forma y la estructura de las proteínas en una solución concentrada. Se puede hacer antes o en paralelo con el experimento NSE. Los métodos adicionales como la dispersión dinámica de la luz y las mediciones de viscosidad proporcionan información sobre la difusión traslacional y la interacción hidrodinámica dentro de la solución de proteína concentrada, y también se recomiendan.
