Este protocolo describe la preparación de muestras y la reducción de datos necesarias para estudios exitosos de eco de espín de neutrones de fluctuaciones colectivas de membrana relevantes para las funciones biológicas y aplicaciones prácticas de membranas lipídicas. NSE accede directamente a la dinámica de la membrana en las escalas de tiempo de nanosegundos de las funciones clave de la membrana con la ventaja única de la sensibilidad a los isótopos para sondear características selectivas de la membrana inaccesibles con otras técnicas. Los estudios de la dinámica de membranas a nanoescala son esenciales para comprender las propiedades subyacentes de la membrana del mecanismo molecular y las interacciones membrana-proteína implicadas en diversas patologías celulares.
El método proporciona a los investigadores nuevos en NSE pautas detalladas sobre el diseño, preparación y caracterización de vesículas lipídicas para experimentos exitosos y el posterior análisis e interpretación de reducción de datos. Demostrando el procedimiento estarán Teshani Kumarage y Julie Nguyen, una estudiante de posgrado y una estudiante de pregrado del laboratorio. Trabajando dentro de una campana, prepare la suspensión lipídica disolviendo los lípidos pesados con precisión en un mililitro de disolvente con mezcla manual.
Seque la solución lipídica haciendo un suave movimiento de un gas inerte en el vial mientras lo gira lentamente en ángulo. Para eliminar completamente el disolvente residual, coloque los viales durante la noche en un horno al vacío a 35 grados centígrados. Al día siguiente, hidratar la película lipídica con dos mililitros de agua pesada para obtener una concentración lipídica de 50 miligramos por mililitro y vórtice la suspensión lipídica hidratada hasta que la película lipídica se disuelva por completo.
A continuación, realice cinco ciclos de congelación-descongelación almacenando el vial de suspensión lipídica hidratada a menos 80 grados centígrados hasta que se congele. Y luego transferirlo a un baño de agua de 35 grados centígrados para descongelar la suspensión de lípidos. Vórtice la suspensión descongelada hasta que sea homogénea antes de pasar al siguiente ciclo.
Antes de comenzar el experimento, ensamble la configuración del extrusor utilizando una membrana de poli-bicarbonato entre dos soportes de membrana y agregue dos filtros de papel en cada lado para proporcionar soporte adicional. Use jeringas de vidrio herméticas para hidratar la membrana de policarbonato pasando 0,3 mililitros de agua pesada a través del conjunto de la membrana varias veces. Después de hidratar la membrana, inserte una jeringa hermética al gas de un mililitro con una solución lipídica de color blanco lechoso preparada en un extremo y una jeringa vacía en el extremo opuesto del aparato extrusor.
Una vez que las jeringas estén conectadas, coloque el conjunto en el bloque extrusor. Programe la bomba manteniendo pulsado el botón Velocidad para introducir la velocidad de extrusión y pulse el botón Diámetro para introducir el diámetro de la jeringa. Luego, presione Retirar hasta que la luz se encienda.
Presione start y espere a que la muestra comience a dispensar en la jeringa vacía. Presione el botón Detener justo antes de que la jeringa de muestra esté completamente vacía. Grabe el volumen dispensado y, a continuación, mantenga pulsado el botón Tasa hasta que aparezca la fase uno en la pantalla.
Manteniendo la luz de retirada apagada, presione el botón de volumen para ingresar el volumen dispensado registrado anteriormente. Presione el botón Tasa nuevamente y use la flecha más arriba a la derecha para acceder a la fase dos. Presione volumen para introducir el mismo valor del volumen dispensado registrado anteriormente.
En esta fase, pulse el botón Retirar hasta que la luz Retirar esté encendida. Repita el ciclo para la fase tres presionando el botón de volumen hasta que LP:SE aparezca en la pantalla y configáralo en 20. Finalmente, presione el botón Tasa, acceda a la fase cuatro y presione el botón de volumen para llegar a la función Stop para finalizar la configuración de la bomba.
Después de programar la bomba, presione Iniciar para comenzar el ciclo de extrusión. Realice de 15 a 20 ciclos de extrusión antes de recoger la suspensión lipídica extruida de color azul ópalo transparente en un vial limpio para las mediciones. Abra el software DAVE y seleccione reducir datos NSE en el menú Reducción de datos.
Cargue los archivos de datos sobre diferentes valores Q utilizando el menú Abrir archivos de eco del archivo. Los archivos cargados aparecerán debajo de los conjuntos de datos disponibles. Haga clic derecho en el archivo seleccionado y etiquételo de acuerdo con la medida a la que corresponde, como Muestra, Celda o Resolución.
Con la pestaña Conjunto de datos, agrupo los píxeles del detector en 2 X 2 para mejorar la relación señal/ruido. Aplique el mismo binning a todos los archivos de Resolución, Celda y Ejemplo. Inspeccione los datos en todos los grupos de píxeles y enmascare aquellos con señales deficientes presionando la tecla Fin en el teclado.
Presione Entrar para acceder a una ventana emergente para aplicar la misma máscara a las cuatro veces. Los píxeles enmascarados se volverán verdes. Asegúrese de que los datos recopilados estén en forma de una señal de eco.
Comience a ajustar el archivo de resolución de la lista de archivos cargados haciendo clic con el botón derecho en el archivo deseado y seleccionando Ajustar operaciones, Ajustar resolución de ecos en el menú emergente. Asegúrese de que los ajustes de las señales de eco produzcan parámetros de ajuste razonables. Para inspeccionar el error asociado a cada parámetro de conexión en todo el detector, seleccione Opciones de imagen y, a continuación, seleccione el parámetro de conexión de interés.
Luego, haga clic derecho en la imagen del detector para acceder a una ventana emergente que muestra un mapa de la barra de errores. Si el ajuste sobre un píxel específico no es satisfactorio, reajuste la señal sobre ese píxel seleccionándolo, presionando la pestaña Ajuste y, a continuación, presionando Ajustar píxel. Introduzca nuevos parámetros de inicio para la fase y el período en la ficha Conexión.
Reduzca el archivo de ejemplo seleccionando el archivo correspondiente de la lista de archivos cargados y etiquetados. Inspeccione todos los píxeles y enmascare los pobres como se describió anteriormente. Luego, haga clic derecho en el archivo y seleccione Ajustar operaciones, Importar fases.
Para el archivo de resolución, ajuste las señales de eco como se describió anteriormente con los valores del período sin cambios y el punto de fase de eco importado de la resolución se ajusta. Introduzca el centro del haz para todos los archivos de datos accediendo a la ficha General e introduciendo los valores del centro del haz X e Y registrados en el experimento. Una vez que se completen los ajustes, calcule la función de dispersión intermedia normalizada haciendo clic derecho en el archivo de muestra deseado de la lista de archivos ajustados y seleccionando Calcular I de Q en el menú emergente.
Introduzca la información necesaria para los archivos de resolución y celda y el número de Q-arcs en la ventana emergente y, a continuación, pulse OK para ver los resultados. Observe que los datos en cian muestran una señal deficiente debido a los efectos del borde del detector y deben eliminarse al compilar diferentes conjuntos de datos Q. Finalmente, guarde los conjuntos de datos reducidos como archivos ASCII y guarde toda la sesión como un proyecto DAVE en la carpeta deseada.
En este estudio, se realizaron las mediciones NSE de muestras liposomales preparadas con diferentes esquemas de deuteración. Las mediciones de NSE de las fluctuaciones de flexión de la membrana se realizan en liposomas totalmente contrastados. Este esquema de deuteración da como resultado una gran diferencia de longitud de dispersión entre el núcleo de la membrana y el entorno del fluido deuterado, mejorando significativamente la señal de dispersión de las membranas liposomales y mejorando las estadísticas de medición de la dinámica de flexión.
Por otro lado, las mediciones NSE de las fluctuaciones del grosor de la membrana de los liposomas muestran desviaciones en relación con la Q a la tercera dependencia de las fluctuaciones de flexión. Para aislar la señal de fluctuación de espesor, la señal obtenida se divide por Q a la tercera y el exceso de dinámica se ajusta a una función lorentzeña en Q.Este método depende de datos de buena calidad, que es más alcanzable con muestras de altas concentraciones y señales de dispersión fuertes. La dinámica sondeada por NSE puede ser explorada sinérgicamente por relaxometría de RMN de deuterio y simulaciones moleculares-dinámicas para ilustrar cómo las estructuras lipídicas moleculares y los motivos de empaquetamiento influyen en las funciones de la membrana.
Los estudios de NSE sobre membranas lipídicas arrojan nueva luz sobre la biofísica de membranas, las intrincadas relaciones de la estructura y dinámica de membranas, y cómo afectan las funciones de membrana y las interacciones membrana-proteína.
