Этот протокол описывает подготовку образцов и уменьшение данных, необходимых для успешных исследований спинового эха нейтронов коллективных флуктуаций мембран, имеющих отношение к биологическим функциям и практическому применению липидных мембран. NSE напрямую обращается к динамике мембраны на наносекундных временных масштабах ключевых мембранных функций с уникальным преимуществом чувствительности к изотопам для зондирования селективных особенностей мембраны, недоступных с другими методами. Исследования динамики мембран на наноуровне имеют важное значение для понимания свойств мембраны молекулярного механизма и мембранно-белковых взаимодействий, замешанных в различных клеточных патологиях.
Метод предоставляет исследователям, новичкам в NSE, подробные рекомендации по проектированию, подготовке и характеристике липидных везикул для успешных экспериментов и последующего анализа и интерпретации сокращения данных. Продемонстрировать процедуру будут Тешани Кумараге и Джули Нгуен, аспирант и студентка лаборатории. Работая внутри вытяжки, подготовьте липидную суспензию, растворив точно взвешенные липиды в одном миллилите растворителя с ручным смешиванием.
Высушите липидный раствор, осторожно вливая инертный газ во флакон, медленно вращая его под углом. Чтобы тщательно удалить остаточный растворитель, поместите флаконы на ночь в вакуумную печь при температуре 35 градусов Цельсия. На следующий день увлажняют липидную пленку двумя миллилитрами тяжелой воды для получения концентрации липидов 50 миллиграммов на миллилитр и вихряют гидратированную липидную суспензию до полного растворения липидной пленки.
Затем выполните пять циклов замораживания-оттаивания, храня флакон с гидратированной липидной суспензией при минус 80 градусах Цельсия до замораживания. А затем перенести его на водяную баню при 35 градусах Цельсия, чтобы разморозить липидную суспензию. Вихрь размороженный суспензии до однородной точки, прежде чем перейти к следующему циклу.
Перед началом эксперимента соберите установку экструдера с использованием поли-бикарбонатной мембраны между двумя мембранными опорами и добавьте два бумажных фильтра с каждой стороны, чтобы обеспечить дополнительную поддержку. Используйте герметичные стеклянные шприцы для гидратации поликарбонатной мембраны, пропуская 0,3 миллилитра тяжелой воды через мембранный узел несколько раз. После гидратации мембраны вставляют в один конец газонепроницаемый шприц на один миллилитр с приготовленным раствором липидов молочно-белого цвета, а в противоположный конец экструдерного аппарата – пустой шприц.
После подключения шприцев поместите узел в блок экструдера. Запрограммируем насос, удерживая кнопку Rate для ввода скорости экструзии и нажав кнопку Diameter, чтобы ввести диаметр шприца. Затем нажимайте «Снять», пока не загорится индикатор.
Нажмите кнопку Пуск и подождите, пока образец начнет дозировать в пустой шприц. Нажмите кнопку Стоп непосредственно перед тем, как образец шприца полностью опустеет. Запишите дозированную громкость, затем удерживайте кнопку «Скорость» до тех пор, пока на экране не появится первая фаза.
Не выключая индикатор «Вывести», нажмите кнопку громкости, чтобы ввести дозированную громкость, записанную ранее. Нажмите кнопку «Скорость» еще раз и используйте стрелку вверх вправо для доступа ко второму этапу. Нажмите «Громкость», чтобы ввести то же значение дозированного объема, которое было записано ранее.
На этом этапе нажимайте кнопку «Вывести», пока не загорится индикатор «Вывести». Повторите цикл для третьей фазы, нажимая кнопку регулировки громкости, пока на экране не появится LP:SE, и установите для нее значение 20. Наконец, нажмите кнопку Rate, получите доступ к четвертому этапу и нажмите кнопку громкости, чтобы нажать функцию Stop, чтобы завершить настройку насоса.
После того, как насос запрограммирован, нажмите кнопку Пуск, чтобы начать цикл экструзии. Выполните от 15 до 20 циклов экструзии, прежде чем собирать прозрачную опаловую синюю экструдированную липидную суспензию в чистый флакон для измерений. Откройте программное обеспечение DAVE и выберите уменьшить данные NSE в меню Сокращение данных.
Загрузите файлы данных с различными значениями Q с помощью меню «Открыть эхо-файлы» в меню «Файл». Загруженные файлы будут отображаться под доступными наборами данных. Щелкните правой кнопкой мыши на выбранном файле и пометьте его в соответствии с измерением, которое он соответствует, например Образец, Ячейка или Разрешение.
На вкладке Набор данных сгруппируйте пиксели детектора в 2 X 2, чтобы улучшить соотношение сигнал/шум. Примените одно и то же биннинг ко всем файлам Разрешения, Ячейки и Образца. Проверьте данные по всем группам пикселей и замаскируйте данные с плохими сигналами, нажав клавишу End на клавиатуре.
Нажмите клавишу ВВОД, чтобы открыть всплывающее окно, чтобы применить одну и ту же маску ко всем четырем временам. Замаскированные пиксели станут зелеными. Убедитесь, что собранные данные в виде эхо-сигнала.
Начните подгонку файла разрешения из списка загруженных файлов, щелкнув правой кнопкой мыши по нужному файлу и выбрав Fit Operations, Fit Echoes Resolution во всплывающем меню. Убедитесь, что припадки эхо-сигналов дают разумные параметры подгонки. Чтобы проверить ошибку, связанную с каждым параметром подгонки, по всему детектору, выберите Параметры изображения, а затем выберите интересующую параметр подгонки.
Затем щелкните правой кнопкой мыши на изображении детектора, чтобы получить доступ к всплывающему окну, показываю карту панели ошибок. Если подгонка по определенному пикселю неудовлетворительна, переназначите сигнал поверх этого пикселя, выбрав его, нажав вкладку «Подгонка», а затем нажав «Попиксель по пикселю». Введите новые начальные параметры для фазы и периода на вкладке Подгонка.
Уменьшите размер файла образца, выбрав соответствующий файл из списка загруженных и помеченных файлов. Проверьте все пиксели и замаскируйте бедные, как описано выше. Затем щелкните правой кнопкой мыши файл и выберите Операции подгонки, Этапы импорта.
Для файла разрешения подогнать эхо-сигналы, как описано выше, со значениями периода без изменений и фазовой точкой эха, импортированной из разрешения. Введите центр луча для всех файлов данных, перейдя на вкладку Общие и введя значения центров пучка X и Y, записанные в эксперименте. После завершения подгонки рассчитайте нормализованную промежуточную функцию рассеяния, щелкнув правой кнопкой мыши нужный образец файла из списка подходящих файлов и выбрав Calculate I of Q во всплывающем меню.
Во всплывающем окне введите необходимую информацию для файлов разрешения и ячеек, а также количество Q-дуг, затем нажмите OK для просмотра результатов. Обратите внимание, что данные в циане показывают плохой сигнал из-за эффектов края детектора и должны быть устранены при компиляции различных наборов данных Q. Наконец, сохраните уменьшенные наборы данных в виде файлов ASCII и сохраните весь сеанс как проект DAVE в нужной папке.
В этом исследовании были проведены измерения NSE липосомальных образцов, подготовленных с различными схемами дейтерации. NSE измерения флуктуаций изгиба мембраны выполняются на полностью контрастных липосомах. Эта схема дейтерации приводит к большой разнице длин рассеяния между ядром мембраны и дейтерированной жидкой средой, значительно усиливая сигнал рассеяния от липосомальных мембран и улучшая статистику измерения динамики изгиба.
С другой стороны, NSE измерения флуктуаций толщины мембраны липосом показывают отклонения относительно Q к третьей зависимости флуктуаций изгиба. Для выделения флуктуаций толщины сигнала полученный сигнал разделяют на Q на третий и избыточную динамику подогнали к лоренциановской функции в Q.Этот метод зависит от данных хорошего качества, которые более достижимы с образцами высоких концентраций и сильными сигналами рассеяния. Динамика, исследуемая NSE, может быть синергетически исследована дейтериевой ЯМР-релаксометрией и молекулярно-динамическим моделированием, чтобы проиллюстрировать, как молекулярные липидные структуры и мотивы упаковки влияют на функции мембраны.
Исследования NSE на липидных мембранах проливают новый свет на биофизику мембран, сложные отношения структуры и динамики мембраны и то, как они влияют на мембранные функции и мембранно-белковые взаимодействия.
