Esta metodología proporciona un enfoque de pérdida de función para los estudios del desarrollo de la retina en el pollito. Esta técnica favorece la supresión rápida y persistente de genes diana en una zona específica de la retina. Este enfoque también se puede aplicar a otras partes del embrión de pollo, incluidos los tejidos neurales y no neurales.
Para la electroporación in ovo, prepare una solución Fast Green al 0,25 % disolviendo 25 miligramos de Fast Green FCF en 10 mililitros de PBS, luego filtre la solución con un filtro de jeringa de 0,2 micras. A continuación, prepare la solución de inyección de cóctel de ADN mezclando el plásmido GFP esmeralda de microARN con el plásmido de expresión de transposasa Tol2 en una proporción de dos a uno. A continuación, añada la solución Fast Green preparada al cóctel de ADN en una proporción de uno a 10 para la visualización de la zona inyectada.
A continuación, configure el aparato de microinyección. El aparato consta de una jeringa Hamilton, una aguja de dos pulgadas de calibre 18, un tubo de cloruro de polivinilo de dos centímetros de largo y una aguja de micropipeta. Llene la jeringa Hamilton con aceite mineral pesado, luego conecte la aguja de calibre 18 a la jeringa y llene el espacio interno de la aguja con aceite presionando el émbolo de la jeringa.
A continuación, conecte el tubo de cloruro de polivinilo al extremo de la aguja y llene el tubo con el aceite. Coloque la aguja de micropipeta tirada en el tubo. Luego, bajo el microscopio de disección con pinzas finas, rompa la punta de la aguja hasta un diámetro de 10 a 20 micrómetros para hacer una pequeña abertura.
Llene toda la aguja con aceite. A continuación, coloque cinco microlitros del cóctel de ADN de colores en una placa de Petri. Bajo el microscopio de disección, coloque la punta de la aguja de la micropipeta en la solución de ADN en la placa de Petri y extraiga lentamente la solución en la aguja.
Después de que la presión se haya equilibrado dentro y fuera de la aguja, saque la punta de la aguja de la solución de ADN y manténgala sumergida en PBS estéril en un vaso de precipitados pequeño hasta la inyección. Luego, para configurar el aparato de electroporación, coloque un par de electrodos de platino firmemente con un portaelectrodos en un micromanipulador. Ajuste el espacio entre la punta de los electrodos a dos milímetros y conecte los electrodos a un generador de pulsos de onda cuadrada con cables.
A continuación, para la microinyección de ADN, retire un huevo de Leghorn blanco fertilizado de la incubadora y limpie la superficie del huevo con papel de seda empapado en etanol al 70%. A continuación, coloque una aguja de calibre 18 en una jeringa de 10 mililitros e inserte la aguja a través del extremo romo del huevo, en ángulo hacia abajo para evitar dañar la yema. Después de retirar de dos a tres mililitros de albúmina del huevo, selle el agujero con un trozo de cinta adhesiva y encienda el huevo con luz para asegurarse de que el embrión y la membrana vitelina se desprendan de la cáscara.
A continuación, con unas pinzas, retira un trozo de cáscara de huevo de la parte superior del huevo, exponiendo el embrión. No coloque más de cinco óvulos en una ventana a la vez para evitar que los embriones se sequen durante la electroporación. Inserte la punta de la aguja en la vesícula óptica desde su lado proximal en un ángulo de 45 grados e inyecte el cóctel de ADN presionando lentamente el émbolo hasta que la solución de color azul llene el lumen.
Retire la aguja y vuelva a colocar la punta en el PBS. Para la electroporación, establezca el voltaje de pulso en 15 voltios, la longitud del pulso en 15 milisegundos, el intervalo de pulso en 915 milisegundos y el número de pulsos en cinco. Después de añadir unas gotas de HBSS en la membrana vitelina sobre el embrión, utilice el micromanipulador para bajar los electrodos en el HBSS perpendicular al eje antero-posterior del embrión.
Coloque los electrodos a ambos lados de la vesícula óptica, asegurándose de que los electrodos no toquen el embrión o los vasos sanguíneos, luego aplique campos eléctricos pulsados. Una vez completada la electroporación, retire los electrodos y limpie suavemente los electrodos con un bastoncillo de algodón estéril empapado en agua para evitar la acumulación de albúmina. Selle la ventana con cinta adhesiva y reincube el embrión hasta la etapa de desarrollo deseada.
La transfección de secuencias individuales de pre-microARN en células de Nel AP que expresan HEK293T dio lugar a una supresión significativa de la expresión de Nel por parte de las construcciones contra los nucleótidos 482 a 502, 910 a 930 y 2461 a 2481. El encadenamiento de dos secuencias de microARN mejoró significativamente la eficiencia de derribo. Las tres combinaciones mostraron actividades de supresión mejoradas en comparación con las secuencias individuales de pre-microARN no encadenadas.
Se observó una supresión robusta al menos 13 días después de la transfección. Cuando una construcción de pre-microARN de Nel dirigida a los nucleótidos 482 a 502 y 2461 a 2481 se transfectó conjuntamente con el vector de expresión de la transposasa en la retina del pollo, la expresión de Nel en el epitelio pigmentario de la retina se redujo significativamente en las células que expresan GFP esmeralda en el día embrionario 4.5. En embriones de ocho días de edad, la expresión de Nel también disminuyó en las células ganglionares de la retina.
Por el contrario, la expresión de Nel en la retina no se vio afectada por la introducción de microARN de control. Después de este procedimiento, se pueden examinar los efectos sobre la supresión de genes diana mediante el uso de varios métodos, como exámenes de proliferación y diferenciación celular, muerte celular y rastreo celular y axónico.
